PEDF34抑制前列腺癌生長(zhǎng)的雙重作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究旨在探討PEDF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能表位，明確PEDF34是否具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡類似的促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)和是否通過相同的死亡受體信號(hào)通路。本研究是從以下三方面展開：(1)運(yùn)用基因工程方法獲得PEDF、PEDF34純化蛋白，在裸鼠前列腺癌異位種植瘤模型上觀察PEDF34抑制前列腺癌生長(zhǎng)的效應(yīng)并探討其作用機(jī)制；(2)分析PEDF34抗血管增生活性，并探討其作用的信號(hào)通路；(3)明確PEDF34是否能夠直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，

2、并系統(tǒng)探討其作用的信號(hào)通路；探討PEDF34促細(xì)胞凋亡作用的受體。
　　 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 第1部分PEDF34重組質(zhì)粒的構(gòu)建及PEDF34蛋白表達(dá)純化
　　 1.成功構(gòu)建pGEX-4T-1/PEDF34重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果表明目的基因片段與pGEX-4T-1連接無誤，閱讀框架正確，pGEX-4T-1/PEDF34重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.獲得高純度可溶性的PEDF34融合蛋白。鑒定正確的

3、重組體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)，表達(dá)出可溶性重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌經(jīng)超聲后，離心取上清，通過GST親和柱Glutathione Sepharose4B純化，獲得高純度可溶性融合蛋白。純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果顯示純化后PEDF34-GST融合蛋白純度可達(dá)95％。純化的重組蛋白經(jīng)Western-blot分析顯示有明顯的免疫雜交帶。
　　 3.凝血酶切割PEDF34-GS

4、T融合蛋白后的再次分離純化。用凝血酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行切割，切割產(chǎn)物采用超濾(Ultrafiltration)方法可分離純化獲得PEDF34功能片段多肽。
　　 4.PEDF34 N-端氨基酸序列測(cè)定及二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定。Edman降解法精確測(cè)定PEDF34多肽N-端氨基酸序列，與理論設(shè)計(jì)相符。采用圓二色譜法(Circulardichroism)測(cè)定純化PEDF34功能片段多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示PEDF34蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，與軟件

5、推測(cè)結(jié)果相符。
　　 第2部分PEDF34通過抗血管新生抑制前列腺癌生長(zhǎng)的作用及分子機(jī)制研究
　　 1.PEDF34抑制裸鼠前列腺癌生長(zhǎng)。腹腔注射PEDF34總劑量為25 mg/kg時(shí)，對(duì)BALB/c裸鼠前列腺癌(PC-3)實(shí)體瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(P＜0.05)，抑瘤率為69.4％；
　　 2.PEDF34抑制前列腺癌血管新生。采用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的CD31抗體，用SP免疫組織化學(xué)法鑒定裸鼠前列腺癌組織的微

6、血管密度(MVD)。結(jié)果表明：PEDF34處理組腫瘤組織血管密度較PBS組減少(P＜0.05)，提示PEDF34通過抗血管新生抑制前列腺癌生長(zhǎng)。
　　 3.PEDF34誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。PEDF34劑量依賴性地抑制HUVECs的存活，IC50為320nmol/L。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PEDF34處理組HUVECs的細(xì)胞凋亡率顯著地高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)，表明PEDF34具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。PEDF34對(duì)正常

7、肝細(xì)胞(chang liver)的存活無明顯的影響，顯示了PEDF34具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞的特異性。
　　 4.PEDF34激活內(nèi)皮細(xì)胞死亡受體信號(hào)通路。
　　 4.1 PEDF34通過激活Fas-FasL死亡受體通路誘導(dǎo)HUVECs凋亡。Westernblotting分析結(jié)果顯示，PEDF34上調(diào)HUVECs細(xì)胞Fas-L的表達(dá)及Caspase-8的切割，而Fas表達(dá)無明顯變化。同時(shí)檢測(cè)了腫瘤組織中Fas-L的表達(dá)及Cas

8、pase8的切割情況，結(jié)果顯示PEDF34處理組的腫瘤組織中Fas-L的表達(dá)高于對(duì)照組，腫瘤組織中的Caspase8的切割高于對(duì)照組，F(xiàn)as無明顯差別。
　　 4.2 PEDF34通過激活轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ上調(diào)Fas-L的表達(dá)。Westernblotting分析結(jié)果顯示，PEDF34上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)。PPAR-γ抑制劑GW9662處理HUVECs后，PEDF34上調(diào)FasL的作用減弱，NF-κB抑制劑PDTC無此

9、作用。證明PEDF34通過激活轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ促進(jìn)Fas-L的表達(dá)。
　　 4.3 JNK通路激活介導(dǎo)PEDF34對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PPAR-γ的調(diào)節(jié)。采用Western-blot法檢測(cè)PEDF34處理不同時(shí)間的HUVECs中MAPK(ERK、JNK、p38)的激活。結(jié)果顯示，PEDF34在15min激活HUVECs中JNK。JNK抑制劑SP600125能抑制PEDF34引起的PPARγ的上調(diào)，表明PEDF34通過激活JNK來激活轉(zhuǎn)

10、錄因子PPARγ。
　　 第3部分PEDF34通過直接誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用及分子機(jī)制
　　 1. PEDF34誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡。運(yùn)用組織切片原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)原位檢測(cè)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示PEDF34處理組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞顯著多于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性(P＜0.05)。提示PEDF34可以直接誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞的凋亡。
　　 2.PEDF34以劑量依賴性方式抑制前列

11、腺癌細(xì)胞PC-3的存活，誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。PEDF34劑量依賴性抑制PC-3的存活，IC50為640nmol/L。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，PEDF34處理組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)，表明PEDF34具有直接誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的作用。PEDF34對(duì)正常肝細(xì)胞(chang liver)的存活無明顯的影響，顯示了PEDF34具有特異性抑制腫瘤細(xì)胞的作用。
　　 4.PEDF34激活前列腺癌細(xì)胞死亡受

12、體信號(hào)通路。
　　 4.1 PEDF34通過激活Fas-Fas-L死亡受體通路誘導(dǎo)PC-3凋亡。Westernblotting分析結(jié)果顯示，PEDF34促進(jìn)PC-3細(xì)胞Fas-L的表達(dá)及細(xì)胞Caspase8的切割，而Fas表達(dá)無明顯變化。同時(shí)檢測(cè)了裸鼠前列腺癌腫瘤組織中Fas-L的表達(dá)及Caspase8的切割情況，結(jié)果顯示PEDF34處理組腫瘤組織的Fas-L的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，腫瘤組織中的Caspase8的切割高于對(duì)照組，F(xiàn)

13、as無明顯差別。運(yùn)用RNA干擾的方法，下調(diào)PC-3細(xì)胞Fas-L的表達(dá)后，PEDF34促凋亡作用明顯降低。證明PEDF34通過Fas-L-caspase-8受體凋亡通路誘導(dǎo)PC-3凋亡。
　　 4.2 PEDF34通過激活轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ促進(jìn)Fas-L的表達(dá)。Westernblotting分析結(jié)果顯示，PEDF34促進(jìn)PC-3細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)，而NF-κB無明顯激活。PPAR-γ抑制劑GW9662處理PC-3細(xì)胞后，P

14、EDF34上調(diào)PC-3細(xì)胞FasL作用減弱，NF-κB抑制劑PDTC無此作用。運(yùn)用RNA干擾的方法，下調(diào)PPARγ與NF-κB的表達(dá)，PPARγ干擾組PEDF34上調(diào)FasL作用減弱，NF-κB干擾組PEDF34仍然上調(diào)FasL。FasL啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，PEDF34上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)FasL啟動(dòng)活性，PPARγ抑制劑GW9662減弱此作用。證明PEDF34可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ促進(jìn)Fas-L的表達(dá)。
　　 4

15、.3JNK通路的激活介導(dǎo)PEDF34對(duì)PC-3細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄功能的發(fā)揮。采用Western-blot法檢測(cè)PEDF處理不同時(shí)間點(diǎn)的PC-3細(xì)胞中MAPK(ERK、JNK、p38)的激活。結(jié)果顯示，PEDF34激活PC-3細(xì)胞中JNK。JNK抑制劑SP600125能抑制PEDF34引起的PPARγ及Fas-L的上調(diào)，表明PEDF34通過激活JNK促進(jìn)PPARγ的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄功能的發(fā)揮。
　　 5.LR受體介導(dǎo)PED

16、F34誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的作用。運(yùn)用LR抗體拮抗后，PEDF34上調(diào)PC-3細(xì)胞FasL的作用減弱。運(yùn)用RNA干擾下調(diào)LR表達(dá)后，能抑制PEDF34引起的PPARγ及Fas-L的上調(diào)，表明PEDF34通過作用于LR受體來介導(dǎo)PPARγ的上調(diào)，發(fā)揮促PC-3凋亡的作用。
　　 結(jié)論及研究意義：
　　 1.運(yùn)用基因工程方法獲得PEDF34純化蛋白，lL細(xì)菌培養(yǎng)物可獲得純化融合蛋白60mg。
　　 2.PEDF34通

17、過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制血管新生抑制前列腺癌生長(zhǎng)。首次闡明PEDF34通過激活轉(zhuǎn)錄因子PPARγ上調(diào)Fas-L從而激活死亡受體通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。該研究闡明了PEDF34誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 3.首次證實(shí)PEDF34具有誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的作用。首次闡明了PEDF34通過激活Fas-Fas-L死亡受體通路誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡；PEDF34對(duì)FasL啟動(dòng)激活依賴轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，而不是NF-κB；JNK MAPK的