刺參（Stichopus japonicus）爛皮病病灶組織顯微觀察及病原的初步研究.pdf

1、刺參(Stichopus japonicus)屬于棘皮動(dòng)物門(mén)海參綱(Holothuroidea)楣手目(Aspidochirota)刺參科(stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus)。刺參為溫帶種，在我國(guó)的分布主要在遼寧，河北，山東和江蘇等沿海省。刺參營(yíng)養(yǎng)豐富，體壁含有豐富的膠原成分和蛋白聚糖，還含有大量的黏蛋白及多種氨基酸。刺參的酸性黏多糖(硫酸軟骨素)，具有抗衰老的作用，還具有較廣的抗腫瘤、抗凝血以及增強(qiáng)機(jī)體免

2、疫功能的作用。 我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始進(jìn)行刺參養(yǎng)殖，目前國(guó)內(nèi)刺參養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。山東、遼寧兩省是我國(guó)的刺參養(yǎng)殖的最主要的養(yǎng)殖區(qū)域，青島、威海、蓬萊等沿海城市都有大規(guī)模的刺參養(yǎng)殖場(chǎng)。隨著國(guó)內(nèi)刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖面積的迅速擴(kuò)張以及集約化養(yǎng)殖方式下的不規(guī)范操作，養(yǎng)殖過(guò)程中相繼出現(xiàn)一系列病害問(wèn)題，給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。 “爛皮病”因其高傳染性，死亡率高而成為刺參養(yǎng)殖病害研究的重點(diǎn)。該病發(fā)病特征：染病初期的海參

3、一般先從口部出現(xiàn)感染，表現(xiàn)為圍口膜松弛，觸手對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，繼而大部分海參會(huì)出現(xiàn)排臟現(xiàn)象。中期感染的刺參身體收縮，僵直，一般口腹部出現(xiàn)小面積潰瘍，形成藍(lán)白色小斑點(diǎn)，漸漸喪失攝食能力，感染末期刺參的病灶變大，潰瘍處增多，表皮腐爛面積變大，最后導(dǎo)致刺參死亡，溶化成鼻涕狀膠體。 本文通過(guò)顯微觀察技術(shù)(H.E.染色切片觀察、電子投射電鏡和掃描電鏡)對(duì)青島某養(yǎng)殖場(chǎng)患病刺參和健康刺參個(gè)體進(jìn)行比較。并對(duì)患病個(gè)體病灶處的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分離、純

4、化和人工回接感染實(shí)驗(yàn)，依據(jù)柯赫氏法則確定病原菌。并通過(guò)革蘭氏染色、細(xì)菌負(fù)染形態(tài)觀察、抗生素敏感實(shí)驗(yàn)、生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rRNA基因進(jìn)化分析對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定和研究。并研究了病灶處優(yōu)勢(shì)菌群16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。 病灶處顯微觀察結(jié)果：患病個(gè)體表皮嚴(yán)重的破損，結(jié)締組織膠原層結(jié)構(gòu)不再緊實(shí)有序，變薄且成絮狀，出現(xiàn)大量空洞。肌肉層肌腱依然可見(jiàn)纖維束狀結(jié)構(gòu)，肌肉纖維束排列緊密，但沒(méi)有成規(guī)律的麥穗狀排列。病灶處各組織未發(fā)現(xiàn)

5、在健康個(gè)體中存在的一種泡狀細(xì)泡。電子透射電鏡觀察結(jié)果顯示患病個(gè)體結(jié)締組織中的細(xì)胞分散，細(xì)胞間質(zhì)稀疏，細(xì)胞間隙較大，胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)單一。細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)喪失，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)散亂；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整。電子掃描電鏡顯微觀察結(jié)果顯示病灶處存在大量球狀細(xì)菌，多附著于骨片和膠原纖維之間。病原研究結(jié)果：共有9株優(yōu)勢(shì)菌株從病灶處分離純化。編號(hào)依次為：C6TB4、BP1～BP6。僅菌株C6可以重復(fù)自然狀態(tài)的發(fā)病狀態(tài)，投放初濃度為10<'8>CFU/mL，致死率為59

6、％以上，確定為養(yǎng)殖刺參爛皮病的病原，培養(yǎng)菌落顏色為玉米黃色，可反射藍(lán)色金屬光澤。菌株C6為革蘭氏陰性長(zhǎng)桿菌，可彎曲，兩端不生鞭毛；大小約為2μm×0.3μm，對(duì)氟哌酸、氯霉素等抗生素表現(xiàn)為敏感；測(cè)試的16項(xiàng)生化指標(biāo)僅氧化酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶結(jié)果為陽(yáng)性。結(jié)合表型，生化指標(biāo)結(jié)果和16S rRNA基因進(jìn)化分析，初步推測(cè)菌株C6為T(mén)enacibaculum屬細(xì)菌。16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系顯示病灶處其他優(yōu)勢(shì)菌群和CFB群以及γ-變形菌門(mén)的交替