仿刺參(Apostichopus japonicus)分子標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、仿刺參主要分布于我國北方，日本，朝鮮半島及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，由于其具有較高的食用和保健價值，成為我國海水養(yǎng)殖的重要物種。為了實現(xiàn)仿刺參養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定發(fā)展，選擇快速生長及抗病性強(qiáng)的刺參新品種是迫切需要的。分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）能加快育種進(jìn)程，促進(jìn)刺參遺傳改良和新品種的培育。本研究探討了仿刺參分子標(biāo)記的有效篩選方法及其在仿刺參分子育種中的應(yīng)用。
　　1.仿刺參分子標(biāo)記的篩查及標(biāo)記開發(fā)<

2、br>　　本文利用仿刺參EST文庫的序列共得到含有微衛(wèi)星的序列730條（2.1％）。將所得序列獨立的212條微衛(wèi)星序列設(shè)計引物，成功擴(kuò)增率為78.8%。成功擴(kuò)增的位點在一個群體的48個個體中檢測多態(tài)性并利用GENE-POP4.0統(tǒng)計主要遺傳學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示137對具有不同程度的多態(tài)性，多態(tài)比例為82%。等位基因數(shù)為2-7個，平均等位基因3.3個。群體觀測雜合度和期望雜合度分別為0.0667-0.6670，0.1769-0.7200。經(jīng)過

3、Bonferroni校正之后26個標(biāo)記偏離哈迪溫伯格平衡。經(jīng)過基因注釋(BLASTX比對)顯示，共有12個標(biāo)記有注釋信息，分別位于不同的12個已知基因。另外通過轉(zhuǎn)錄組測序共獲得54,185個候選SNP位點。利用高分辨率溶解曲線技術(shù)（High Resolution Melting，HRM）技術(shù)對其中678個候選SNP進(jìn)行標(biāo)記的篩查并在群體的48個個體中進(jìn)行主要遺傳學(xué)參數(shù)的估計。結(jié)果顯示249個為多態(tài)位點。群體觀測雜合度Ho和預(yù)期雜合度He

4、的分布范圍分別為0.050-0.833和0.073-0.907。33個位點偏離哈代-溫伯格平衡。經(jīng)過基因注釋顯示，共有70個標(biāo)記有注釋信息。這些來源于EST的分子標(biāo)記為將來仿刺參遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。
　　2.基于微衛(wèi)星標(biāo)記的仿刺參家系鑒定
　　本研究利用軟件模擬及實際混養(yǎng)家系分析，建立了一套可以用于仿刺參家系鑒定的微衛(wèi)星分子標(biāo)記系統(tǒng)。我們利用12個微衛(wèi)星標(biāo)記來模擬排除率，結(jié)果顯示9個標(biāo)記的排除率是和12個標(biāo)記相當(dāng)?shù)模?/p>

5、均達(dá)到99%以上。并用9個微衛(wèi)星標(biāo)記在九個已區(qū)分家系的180個幼蟲中進(jìn)行評價。最終所有幼蟲均準(zhǔn)確地分到各自的家系。說明這個標(biāo)記組合足以達(dá)到區(qū)分個體的目的。我們又利用9個微衛(wèi)星標(biāo)記在混合家系的1000頭仿刺參進(jìn)行家系鑒定，最終共有810頭仿刺參確定了各自的親本，混養(yǎng)家系的鑒定率81.0%。
　　3.仿刺參遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位
　　本文采用兩個F1作圖群體均是根據(jù)“擬測交”策略構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。利用的微衛(wèi)星標(biāo)記313個，S

6、NP標(biāo)記249個。我們分別構(gòu)建雌雄連鎖圖譜，連鎖群數(shù)目均為22，與最近報道的仿刺參單倍染色體數(shù)目一致。雌性圖譜重組率顯著比雄性圖譜的高(G檢驗 P<0.01)。家系間重組率的比較通過連鎖群之間共享標(biāo)記間隔的差異來顯示，結(jié)果表明，大部分標(biāo)記是相似的，但是也有差異顯著的連鎖群如（LG2-M，LG11-M，LG9-F，L13-F，L18-F）。性別平均圖譜總共含有215個標(biāo)記（121個微衛(wèi)星和94個SNP），圖譜總長為1498.9 cM，平均

7、密度為7.0 cM。連鎖群長度為44.4 cM到121.4 cM不等，連鎖群標(biāo)記數(shù)目為5-18個不等。雌雄性遺傳連鎖圖譜的基因組覆蓋率分別為74.8和72.8%，整合連鎖圖譜的圖譜覆蓋率為79.2%。所有EST來源的分子標(biāo)記進(jìn)行基因注釋，結(jié)果顯示16個包含標(biāo)記的EST序列與已知功能的基因同源，而其他的沒有注釋信息。并對其進(jìn)行Tblastx比對，結(jié)果顯示在134條比對序列中，24條序列（17.9%）在海膽海參中同源(e<10-7)。采用兩