仿刺參（Apostichopus japonicus）水溶性海參皂苷的分離純化及其藥理活性研究.pdf

1、皂苷(或皂甙)廣泛存在于部分陸生植物和海洋棘皮動物海參和海星中，具有溶血、抗腫瘤、抗真菌、細(xì)胞毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制Na<'+>-K<'+>-ATP酶等多種生理和藥理學(xué)活性。海參體內(nèi)富含的海參皂苷，是一類主要的次生代謝產(chǎn)物。目前，對海參皂苷的分離制備主要采用乙醇或甲醇等有機(jī)溶劑萃取法，但這類方法不僅有機(jī)溶劑使用量大、成本高、易污染環(huán)境、不適于工業(yè)化生產(chǎn)，而且所得海參皂苷制品的水溶性較差，限制了海參皂苷在醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用途徑和應(yīng)用范圍。遺憾的

2、是，至今還未見到有關(guān)水溶性海參皂苷分離純化及生物活性的研究報道。為此，本文以仿刺參(Apostichopus japonicus)為材料建立了其水溶性海參皂苷的提取方法，利用各種層析技術(shù)對水溶性海參皂苷進(jìn)行了分離純化，并對各種皂苷制品的抗菌活性進(jìn)行了研究，利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了抗腫瘤活性研究，并進(jìn)行了抗氧化和驅(qū)蠅活性研究，旨在篩選出具有強(qiáng)抗真菌和抗腫瘤活性的水溶性海參皂苷純化樣品，為利用水溶性海參皂苷研制高效抗真菌、抗腫瘤及驅(qū)蠅藥

3、物創(chuàng)造條件。 利用正交實驗對從凍干仿刺參加工廢棄液中制備水溶性海參皂苷的技術(shù)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，從凍干仿刺參廢棄液中分離制備水溶性海參皂苷的最佳技術(shù)工藝條件為：仿刺參廢棄液pH值為10，AB-8大孔樹脂柱的上樣速率為2倍柱體積(BV)/h、洗脫用乙醇濃度為70％、洗脫體積為6 BV。該技術(shù)工藝具有操作簡單、有機(jī)溶劑使用量少、適合于工業(yè)化生產(chǎn)等諸多特點，不僅可用于水溶性海參皂苷的大規(guī)模制備和生產(chǎn)，而且還充分利用了凍干仿刺參加

4、工廢棄液，有效避免了因該廢棄液排放所造成的環(huán)境污染問題。 從凍干仿刺參廢棄液中分離制備出的水溶性海參皂苷屬于三萜皂苷；抑菌結(jié)果表明，水溶性海參皂苷對裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酵母菌啤酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黃瓜枯萎病原菌(Fusarium

5、 oxysporum f.sp.cucumerinum)和霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)均具有顯著的抑菌活性，其最低抑菌濃度MIC值分別為0.002、0.016、0.063、0.063、0.125和0.250 mg/mL，而對枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Eschetichia coli)和綠膿桿菌(Pseudomonas a

6、eruginosa)均沒有抑制作用；所得皂苷對體外培養(yǎng)的HeLa宮頸癌細(xì)胞、A-549肺癌細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞和Bel-7402肝癌細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制活性，IC<,50>值分別為16.39、13.98、14.51和15.29 μg/mL；濃度為20 mg/mL的皂苷在24 h內(nèi)具有顯著的驅(qū)蠅活性；所得皂苷沒有明顯的抗氧化活性。將所得水溶性海參皂苷再次上樣于AB-8大孔樹脂柱，分別利用30％、50％、70％、80％和95％

7、進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)70％、80％和95％乙醇溶液洗脫組分不僅對6種真菌具有顯著的抗真菌活性，而且對體外培養(yǎng)的4種癌細(xì)胞也均具有顯著的抗腫瘤活性。 所得具有顯著抗真菌活性和抗腫瘤活性的70％乙醇溶液洗脫組分，經(jīng)硅膠柱層析和Sephadex LH-20柱層析進(jìn)一步純化后，獲得了4種水溶性海參皂苷單體組分SCl-4，其中SC-2、SC-3和SC-4的純度分別為99.6％、99.8％和96.2％；SC-2和SC-3具有極強(qiáng)的抗真菌和抗腫瘤活

8、性，它們對裂殖酵母菌、啤酒酵母菌、白色念珠菌、葡萄炭疽病原菌、黃瓜枯萎病原菌和黑曲霉的MIC值相同，分別為0.25、4、8、<32、32和<32μg/mL；SC-2和SC-3對體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞、A-549細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性，SC-2對4種癌細(xì)胞的IC<,50>值分別為3.23、4.13、4.41和3.04 μg/mL，SC.3的IC<,50>值分別為3.49、4.11、4.26和3

9、.15 μg/mL。 利用S<,180>荷瘤小鼠對水溶性海參皂苷單體組分SC-2體內(nèi)抗腫瘤活性的鑒定結(jié)果表明，劑量為2、5和10 μg/g體重的SC-2單體組分，能顯著抑制小鼠S180實體瘤的生長，其對實體瘤的抑制率分別為33.88％、38.93％和47.84％；劑量為2、5和10 μg/g體重的SC-2單誶組分能顯著提高S<,180>荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)(P<0.01)，也能不同程度地提高S<,180>荷瘤小鼠的脾指數(shù)。利用體外

10、培養(yǎng)HeLa細(xì)胞和吖啶橙/溴化乙錠雙染色法對SC-2單體組分的抗腫瘤作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)SC-2具有誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力，濃度為50 μg/mL時在12h內(nèi)可誘導(dǎo)幾乎所有細(xì)胞發(fā)生凋亡，且濃度為10和50 μg/mL SC-2處理12h后的HeLa細(xì)胞均出現(xiàn)了明顯的DNA斷片化。說明水溶性海參皂苷單體組分SC-2之所以具有抗癌活性，主要是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。 本文在國內(nèi)外首次建立了制備水溶性海參皂