異常糖基化修飾IgG的實驗診斷價值和病理意義研究.pdf

1、惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療對腫瘤患者預(yù)后至關(guān)重要。腫瘤的診斷從定性到定量、定位已取得長足發(fā)展。甲胎蛋白(AFP)與癌胚抗原(CEA)等是非創(chuàng)性篩查及輔助診斷的代表性腫瘤標志物。但由于惡性腫瘤的形成是一個多因素、多階段、多種生物學(xué)行為共同作用的結(jié)果，難以獲得共同而單一的特異抗原，因此腫瘤血液診斷學(xué)研究仍是一個不斷發(fā)展和認識的過程。腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中包含著活躍的蛋白質(zhì)糖基化過程。IgG是血液中重

2、要的糖蛋白。腫瘤患者外周血中是否存在著IgG的糖基化改變?若有，這種改變可用于腫瘤診斷嗎?其對IgG功能的影響又如何呢?
　　 本研究通過大樣本臨床研究，對我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤(肝癌和大腸癌)中IgGN-糖基化修飾的特征性改變進行分析，建立并評價基于IgGN-糖組的診斷模型，旨在提高消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期診斷的敏感性和特異性；根據(jù)疾病狀態(tài)下的IgGN-糖組改變，對抗EGFRIgG1抗體(西妥昔)的CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株進行相應(yīng)糖基

3、轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控，檢測IgGN-糖組改變對其功能的影響。
　　 第一部分：IgGN-糖組在HBV相關(guān)原發(fā)性肝細胞癌中的診斷和預(yù)后價值研究
　　 本研究的目的是通過對HBV攜帶者、肝硬化、原發(fā)性肝細胞癌(HCC)和健康對照組IgGN-糖組圖譜的分析，尋找可用于從HBV相關(guān)肝病或肝硬化中鑒別診斷HCC的IgGN-糖標志物，并用ROC曲線對其進行診斷效力評估。本研究共收集387例血清用于診斷模型的建立(n=150)及診斷模型的效力

4、驗證(4組，共n=237)。采用小扁豆凝集素(LCA)或蛋白A/G親和層析柱與免疫比濁法相結(jié)合的方法進行血清核心巖藻糖基化IgG的定量測定。以基于DNA測序儀的熒光糖電泳法(DSA-FACE)進行IgG的N-糖組圖譜分析。在建模組和四個驗證組中對IgGN-糖的診斷效力進行評估。并在對55例HCC患者的36個月的術(shù)后隨訪研究中進一步評估IgGN-糖的預(yù)后價值。ELISA法檢測四個肝癌細胞系培養(yǎng)上清的IgG水平，從而評價腫瘤細胞的IgG分泌

5、能力。研究發(fā)現(xiàn)：在建模組中，血清IgG的核心巖藻糖基化水平(LCA-IgG/IgG×100％)具有比甲胎蛋白更好的診斷價值(正確率和靈敏度分別提高13％和25％以上)。多個獨立的驗證組進一步證實了LCA-IgG/IgG具有良好的HCC鑒別診斷效力(尤其是從肝硬化中鑒別診斷HCC)。血清IgG中LCA-IgG/IgG和Peak1(IgG中無半乳糖的核心巖藻糖基化的兩天線糖鏈)豐度高的患者術(shù)后生存率更低。體外肝癌細胞系IgG測定證實了肝癌細

6、胞可以分泌IgG。綜上所述，LCA-IgG/IgG對現(xiàn)有HCC診斷標志物甲胎蛋白和甲胎蛋白異質(zhì)體有很好的補充作用，有望成為全新的非創(chuàng)性的HCC診斷標志物；血清IgG中的LCA-IgG/IgG和Peak1豐度有較好的HCC預(yù)后價值。
　　 第二部分：大腸癌中血清IgGN-糖的診斷價值
　　 應(yīng)用DSA-FACE法對大腸腺瘤(n=66)、大腸癌(n=97)和健康對照組(n=65)的N-糖組圖譜進行分析，明確大腸癌中IgGN-

7、糖的特征性改變。并在此基礎(chǔ)上，建立基于IgGN-糖改變的大腸癌診斷模型。采用小扁豆凝集素(LCA)親和層析柱與免疫比濁法相結(jié)合的方法進行血清核心巖藻糖基化IgG的定量測定。IgGN-糖組圖譜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者血清IgG中存在多個糖鏈豐度的顯著升高[無半乳糖的核心巖藻糖基化的兩天線糖鏈Peak1，有或無雙天線半乳糖基化的二等分乙酰葡糖胺基化的糖鏈(Peak2和Peak7)]；與健康對照相比，核心巖藻糖結(jié)構(gòu)豐度總和(Sumfuc)在大

8、腸腺瘤和大腸癌中均顯著升高?；贗gGN-糖改變的大腸癌診斷模型研究發(fā)現(xiàn)：Log(P1+P2)的ROC曲線下面積為0.703。與CEA(臨界值為2.92ng/ml)相比，Log(P1+P2)的敏感度提高了28％，準確率提高了7％；在術(shù)前-術(shù)后配對比較中，術(shù)后Log(P1+P2)明顯下降。且其與大腸癌患者的術(shù)后生存時間成負相關(guān)(P＜0.05)。因此，我們認為基于IgGN-糖的Log(P1+P2)可以成為潛在的大腸癌診斷指標。
　　

9、 第三部分：糖基化修飾改變對抗EGFR抗體(西妥昔)功能的影響
　　 腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中包含著活躍的蛋白質(zhì)糖基化過程。IgG是血液中重要的糖蛋白。該部分的目的是研究腫瘤中存在的IgG糖基化改變是否對IgG功能有影響。
　　 通過前兩部分對HBV相關(guān)肝病(n=150)和大腸疾病(n=227)中血清IgGN-糖圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)大腸癌患者和肝硬化患者血清IgG中的二等分乙酰葡糖胺的糖鏈豐度較其相應(yīng)的健康和疾病對照組均顯著上升

10、。
　　 為了檢測二等分乙酰葡糖胺基化糖鏈豐度的升高對IgG功能的影響，我們對穩(wěn)定表達抗EGFR的人鼠嵌合IgG1抗體(西妥昔)的CHO細胞株進行了二等分乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(β，1-4-N-acetylglucosaminyltransferaseⅢ，GnT-Ⅲ)的共表達。DSA-FACE圖譜分析發(fā)現(xiàn)：Gn-TⅢ可將二等分乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運至西妥昔的N-糖鏈上，本研究獲得的三株西妥昔CHO細胞株表達的西妥昔二等分乙酰葡糖胺基化呈現(xiàn)不同

11、程度的增加(7.16％-41.39％)。通過細胞增殖實驗檢測各抗體Fab片段(通過與人細胞表面EGFR結(jié)合)對EGFR陽性細胞的殺傷能力。以健康人外周血淋巴細胞為效應(yīng)細胞，通過檢測細胞殺傷標志物乳酸脫氫酶來評價乙酰葡糖胺基化上調(diào)后各抗體的抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)。結(jié)果顯示：西妥昔中二等分乙酰葡糖胺糖鏈豐度的增加，不僅可提高西妥昔Fab段介導(dǎo)的對EGFR陽性細胞的殺傷作用，還可顯著提高其對EGFR陽性細胞的ADCC作用。