與人遺傳病相關的DNA重復序列PCR條件優(yōu)化及遺傳不穩(wěn)定性的研究.pdf

1、近年來,人們已經發(fā)現40余種人類神經系統(tǒng)疾病與DNA重復序列擴增或刪除有關,這些疾病所涉及的重復序列的一個共同特點是以非孟德爾遺傳方式在世代間發(fā)生動態(tài)突變,且往往伴隨著遺傳早現現象。
　　進行與人類遺傳病相關的重復序列的遺傳不穩(wěn)定性的研究時,應用PCR檢測重組質粒內含有的重復序列長度是一個基本的實驗方法。我們采用L9(34)正交實驗法,對與人神經系統(tǒng)疾病相關的DNA重復序列PCR擴增體系中的模板DNA濃度、Taq酶濃度、引物濃度、

2、dNTP濃度等4種影響因素進行了優(yōu)化篩選,發(fā)現引物濃度對擴增結果影響的顯著性最大。在此基礎上進行了引物濃度單因素實驗,得到最優(yōu)DNA重復序列PCR擴增體系在25μL反應體系中各組分的最適濃度分別為:模板3 ng/μL、Taq酶0.75 U、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。通過優(yōu)化前后反應體系的對比,擴增目的產物的量有較大程度的提高。該優(yōu)化體系的建立為進一步研究和人遺傳病相關的DNA重復序列的遺傳不穩(wěn)定性奠定了基礎

3、。
　　在研究人類神經系統(tǒng)疾病的遺傳不穩(wěn)定性及藥物作用的影響時,需要制備成百上千的PCR樣品進行定性檢測重復序列的長度變化情況。為了探索含重復序列質粒PCR模板的快速簡易制備方法,本文分別利用高速離心法、TE煮沸法和TE/SDS煮沸法處理過夜培養(yǎng)的含重組質粒大腸桿菌菌體,制備模板后進行PCR擴增發(fā)現,均能得到比較清晰的目的條帶,可以用于含重復序列質粒的初步鑒定。相比較而言,高速離心5min、TE煮沸3min、TE/SDS煮沸2.5

4、min制備的樣品PCR擴增后效果較好。這三種方法快速、簡便、費用低、無污染,簡化了PCR模板制備的過程,為藥物處理后重復序列長度大量鑒定的研究奠定了基礎。
　　多核苷酸的重復只有超過一定的閾值時才可能導致遺傳病的發(fā)生,如果能夠控制重復次數從而抑制其擴增或運用一種方法使擴增的重復序列刪除縮短,對于由 DNA重復序列引起的神經系統(tǒng)遺傳病的治療及預防具有非常重要的意義。我們利用絲裂霉素C和甲基磺酸乙酯兩種化學藥物,在10％的菌體存活率下