

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1、研究背景:惡性腫瘤起病隱匿,微小癌灶的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移難以早期發(fā)現(xiàn)和和診斷,影響及時(shí)治療,這是影響患者生存期的主要原因.因此,闡明腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制,確立可靠的實(shí)驗(yàn)室預(yù)后指標(biāo)和探索治療惡性腫瘤靶點(diǎn)對(duì)惡性腫瘤患者臨床治療極為重要。 研究發(fā)現(xiàn),隨著腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的發(fā)生,腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑癌蛋白的表達(dá)量減少,逐漸失去對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的抑制,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移.而抑癌基因的失活是編碼蛋白量減少的重要機(jī)制之一.為揭示抑癌基因失活的機(jī)理,國(guó)
2、內(nèi)外針對(duì)P53、P16等抑癌基因作了大量研究,結(jié)果表明基因的遺傳不穩(wěn)定性改變,即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instablility,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)可能是產(chǎn)生基因突變,導(dǎo)致抑癌基因功能失調(diào),引起腫瘤發(fā)生的重要因素. 微衛(wèi)星是由2~6個(gè)核苷酸組成,具有高度多態(tài)性的簡(jiǎn)單串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列.MSI是指由于復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致微衛(wèi)星的增多或減少.LOH是指一個(gè)位點(diǎn)上
3、兩個(gè)多態(tài)性的等位基因中的一個(gè)出現(xiàn)缺失或變異.大量研究表明,抑癌基因MSI與LOH在腫瘤的多步驟發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用.MSI首先是在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(heredity non—polyposis colorectal cancer,HNPCC)中發(fā)現(xiàn)的,隨后在各種散發(fā)性腫瘤,如大腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)MSI。研究表明MSI的發(fā)生提高了隨機(jī)突變率,更重要的是導(dǎo)致了腫瘤相關(guān)基因的突變,可能是引起腫瘤
4、發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。若DNA復(fù)制錯(cuò)誤的結(jié)果是等位基因片段的缺失,則導(dǎo)致LOH的發(fā)生.研究發(fā)現(xiàn)與抑癌基因相關(guān)的雜合性微衛(wèi)星位點(diǎn)常伴有等位基因的丟失,印LOH的發(fā)生.所以分析LOH已成為目前檢測(cè)抑癌基因失活、發(fā)現(xiàn)和定位新的腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene,TSG)的重要手段之一。 分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(Secreted Frizzled—related Protein1,sFRP1)定位于8p12-p11.1
5、,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。sFRP1基因近年來(lái)作為一種候選抑癌基因而研究,其編碼一種分泌性糖蛋白,是Wnt信號(hào)通路的一種上游抑制物。sFRP1蛋白約由313個(gè)氨基酸構(gòu)成,大小約35.3kDa.Wnt/β—catenin信號(hào)途徑的作用特點(diǎn)是:在缺乏Wnt信號(hào)時(shí),胞漿內(nèi)新合成的β—catenin維持在一個(gè)穩(wěn)定的低水平。β—catenin與胞漿中由多種蛋白包括APC(adenomatous polyposis coli)、GSK-3β(g
6、lycogen synthase kinase-3β)、Axin、β—TrCP/Slimb等組成的“降解復(fù)合物”結(jié)合,Axin和APC提供一個(gè)使GSK-3β和β—catenin附著的支架,GSK-3β能夠使β—cateninNH2端的絲/蘇氨酸殘基磷酸化。被磷酸化了的β—catenin可以被β—TrCP識(shí)別并進(jìn)而被其泛素化,β—catenin以蛋白酶體的方式迅速降解,這樣胞漿中游離β—catenin就保持在低水平而不會(huì)有過(guò)多沉積。當(dāng)Wn
7、t信號(hào)存在時(shí),Wnt蛋白與蛇根堿受體家族的7次跨膜卷曲蛋白(Frz)的胞外區(qū)結(jié)合,在低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL—receptor—related protein,LRP)協(xié)同作用下,存在于細(xì)胞漿中的Dishevelled(Dvl或Dsh)蛋白被募集至胞膜下,Dvl能夠把GSK-3β磷酸化,致GSK-3β從Axin上脫落,β—catenin不能被降解,大量游離的β—catenin在胞漿中聚集并進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在核內(nèi)無(wú)β—caten
8、in時(shí)轉(zhuǎn)錄因子家族的TCF/LEF通過(guò)HMG金(HMG boxes)與DNA結(jié)合,DNA的轉(zhuǎn)錄活性被抑制。β—catenin與TCF/LCF結(jié)合形成復(fù)合體后,TCF/LEF抑制作用被解除,特異地啟動(dòng)、激活下游Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已經(jīng)證實(shí)的靶基因包括c—myc、cyclinD1等。而這些靶基因與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān). sFRP1與Wnt的受體卷曲蛋白(frizzled,F(xiàn)rz)受體的胞外區(qū)有相似的核苷
9、酸序列,但是,與Frz受體不同,sFRP1缺乏用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt信號(hào)的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),因此,sFRP1通過(guò)與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白,或直接與Wnt蛋白結(jié)合,由此阻斷了Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路,sFRP1基因的表達(dá)沉默,可引起Wnt的持續(xù)存在,激活Wnt靶基因,導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、惡化.目前發(fā)現(xiàn)有十幾種已知的高發(fā)性癌變?cè)从赪nt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)。既往研究表明,在結(jié)腸癌、肺癌、子宮癌、乳腺癌、食管癌中,sFRP1表達(dá)下調(diào)與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。Shi
10、h.YH等研究指出,91.5%的HCCs相對(duì)于癌旁肝組織的sFRP1表達(dá)量下調(diào),說(shuō)明其在HCC中同樣發(fā)揮抑癌作用,導(dǎo)致其表達(dá)沉默的機(jī)制之一為啟動(dòng)子甲基化,值得注意的是,在未能檢測(cè)出啟動(dòng)子甲基化的HCCs病例中,同樣存在sFRP1蛋白的下調(diào),說(shuō)明有其他機(jī)制參與其表達(dá)沉默,如LOH.有關(guān)sFRP1基因的研究,目前多集中于啟動(dòng)子甲基化的研究,而該基因的遺傳不穩(wěn)定性研究少見(jiàn). 研究目的 研究sFRP1基因D8S532位點(diǎn)、D8S
11、1722位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstablility,MSI)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),對(duì)其蛋白表達(dá)的影響,闡明sFRP1基因遺傳不穩(wěn)定性與肝癌進(jìn)展的關(guān)系,為揭示抑癌基因作用機(jī)制和腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 研究方法 (1)苯酚—氯仿抽提法,提取石蠟包埋肝癌組織的基因組DNA.(2)PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、常規(guī)銀染檢測(cè)位點(diǎn)的遺傳不穩(wěn)定性
12、.(3)Envision免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)蛋白表達(dá).(4)Leica—Qwin計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)攝像并存入計(jì)算機(jī),Image—Pro PluS(IPP)Version4.5專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行蛋白分析.(5)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)性。 研究結(jié)果 (1)肝癌sFRP1基因遺傳不穩(wěn)定性及腫瘤臨床病理特性的相關(guān)性研究:①42例肝癌中D8S532位點(diǎn)的LOH和MSI檢出率分別為11.90%(5/42)和9.52%(4/42)
13、。該位點(diǎn)LOH發(fā)生率與患者年齡、性別、脈管轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、腫瘤大小、AFP、ALT和TB均無(wú)明顯相關(guān)性;MSI發(fā)生率在60歲以上年齡組(>=60),高于60歲以下年齡組組(<60)(23.53%vs0.00%,P<0.05),與其他臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性.②42例肝癌中D8S1722位點(diǎn)的LOH檢出率為14.29%(6/42),MSI檢出率為9.52%(4/42)(表2)。該位點(diǎn)LOH、MSI與患者年齡、性別、脈管轉(zhuǎn)移、T
14、NM分期、分化程度、腫瘤大小、AFP、ALT和TB均無(wú)相關(guān)性。 (2)肝癌sFRP1蛋白表達(dá)與遺傳不穩(wěn)定性的相關(guān)性研究:①對(duì)照于癌旁肝組織,42例肝癌組織,88.10%(37/42)的sFRP1蛋白有不同程度表達(dá)下降;肝癌中sFRP1蛋白陽(yáng)性檢出率為47.62%(20/42)。②肝癌高分化組中sFRP1蛋白陽(yáng)性率為100.00%,高于中低分化組的23.53%(P<0.05)。③蛋白表達(dá)陽(yáng)性組中D8S532 LOH發(fā)生率(0.00
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