WYMV侵染形成的膜狀內(nèi)含體組成及其形成機(jī)制分析.pdf

1、病毒在其生命活動(dòng)中常改變寄主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticular,ER)或其他生物膜系統(tǒng)，以利于其生物代謝活動(dòng)。馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)成員在侵染植株的過程中，能利用寄主細(xì)胞因子誘導(dǎo)形成膜狀內(nèi)含體(membranous inclusion bodies)等多種復(fù)合體結(jié)構(gòu)。膜狀內(nèi)含體的組成成分、形成機(jī)制，以及在病毒復(fù)制、裝配過程中所起到的生物學(xué)功能目前還不清楚。

2、>　　本研究通過對(duì)大麥黃花葉病毒屬成員小麥黃花葉病毒(wheatyellow mosaic virus, WYMV)侵染的小麥葉片進(jìn)行免疫電鏡觀察，明確WYMV編碼的P1、P2和P3是膜狀內(nèi)含體組成的主要病毒蛋白，同時(shí)NIa-Pro(nuclear inclusion a-proteinase)和VPg(viral protein genome-linked)可能是次要的組成部分。同時(shí)，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔典型識(shí)別信號(hào) HDEL（His-asp

3、-glu-leu四肽）抗血清進(jìn)行免疫膠體金標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其也能定位到膜狀內(nèi)含體結(jié)構(gòu)，從而表明寄主內(nèi)膜也參與了膜狀內(nèi)含體形成。亞細(xì)胞定位分析顯示P1、P2與寄主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)，P3既有定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，也有定位在高爾基體(Golgi apparatus)上。生物信息分析和化學(xué)處理實(shí)驗(yàn)顯示P2是一類整合膜蛋白(integral protein)，其介導(dǎo)形成的膜狀聚集體(membranous aggregates)依賴于寄主細(xì)胞內(nèi)膜-高爾基體分泌途

4、徑的運(yùn)輸；P1是膜周邊蛋白(peripheral protein)；P3為整合膜蛋白，其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸也與寄主細(xì)胞內(nèi)的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有關(guān)。雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)分析表明P1不僅可以自我互作，并且與WYMV編碼的P2、P3、VPg、7K(7 kDa protein)、CI(cylindrical inclusion protein)、NIa-P

5、ro、NIb(nuclear inclusion protein b)、以及CP(capsid protein)互作。P1、P2、P3能夠自我互作，并且彼此間也能互作，進(jìn)而形成穩(wěn)定的多元復(fù)合體。在此基礎(chǔ)上，我們還分析了VPg和NIa-Pro的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果表明，VPg-eGFP主要定位于細(xì)胞核中，NIa-Pro-eGFP無特異性亞細(xì)胞定位，廣泛地分布于整個(gè)細(xì)胞周質(zhì)中。
　　在所鑒定與膜狀內(nèi)含體相關(guān)的病毒蛋白中（WYMV編碼的

6、蛋白），只有P2能夠誘導(dǎo)寄主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重排并形成較大的聚集體結(jié)構(gòu)。植物體內(nèi)以及體外檢測(cè)分析也證實(shí)P2能夠通過與P1、P3、NIa-Pro和VPg互作，從而招募這些病毒蛋白到其形成的聚集體中。用感染W(wǎng)YMV的小麥病葉制備原生質(zhì)體，然后進(jìn)行體內(nèi)免疫熒光雙標(biāo)記，其結(jié)果表明在與P2相關(guān)的膜狀內(nèi)含體結(jié)構(gòu)中有病毒RNA的合成。因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步揭示了WYMV侵染形成的膜狀內(nèi)含體組成及其形成機(jī)制，以及P2在膜狀內(nèi)含體形成過程中所發(fā)揮的重要作用。