微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化虎杖的研究.pdf

1、虎杖其有效成分主要為二苯乙烯類和葸醌類化合物，前者主要是白藜蘆醇及其糖苷，后者主要是大黃素及其糖苷，其中以二苯乙烯類化合物具有顯著獨(dú)特的功效。據(jù)報(bào)道干燥虎杖根莖中白藜蘆醇的含量為0.1％～0.2％，而虎杖苷含量為2％左右，虎杖苷在腸道中可被糖苷酶分解釋放出白藜蘆醇，發(fā)揮藥理作用。白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和具有冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥的防治作用，白藜蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥

2、物之一。虎杖中另一有效成分大黃素除游離部分外，尚有部分以β-葡萄糖苷鍵的形式連接為大黃素8-O-B-D-葡萄糖苷等苷類結(jié)構(gòu)形式，大黃素具有抗菌活性，還具有抗腫瘤活性、免疫抑制作用、解痙、止咳作用、保護(hù)心血管、利尿等作用。 目前有研究用酸堿水解法分別對(duì)虎杖苷和大黃素8—O-β—D-葡萄糖苷進(jìn)行分解，但是酸堿會(huì)造成環(huán)境污染，降低產(chǎn)量，因此不宣用化學(xué)法進(jìn)行水解。目前也有用改性纖維素酶直接對(duì)虎杖苷進(jìn)行分解，但成本較高、工藝較為復(fù)雜，不利

3、于推廣應(yīng)用。本項(xiàng)研究采用微生物發(fā)酵法高效的將虎杖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇，同時(shí)對(duì)大黃素8-O-B-D-葡萄糖苷也起到一定的轉(zhuǎn)化效果，副產(chǎn)物大黃素的含量也提高．此方法既沒(méi)有強(qiáng)烈的酸堿反應(yīng)發(fā)生，又無(wú)需粗提苷，因此有效的避免了上述兩種方法存在的缺陷。因此利用專一微生物進(jìn)行發(fā)酵是提高虎杖中自藜蘆醇和副產(chǎn)物大黃素含量的有效途徑之一。 本項(xiàng)研究主要是利用根霉T-34與中藥虎杖共發(fā)酵提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量，其主要內(nèi)容包括：Ⅰ、轉(zhuǎn)化虎杖苷和大黃素8-O-β

4、-D-葡萄糖苷的菌種篩選Ⅱ、根霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化虎杖中虎杖苷工藝條件的優(yōu)化Ⅲ、根霉發(fā)酵虎杖的動(dòng)力學(xué)研究Ⅳ、白藜蘆醇及副產(chǎn)物大黃素的分離提取本研究的主要研究結(jié)果如下： Ⅰ、根據(jù)糖苷鍵類型，結(jié)合微生物篩菌技術(shù)，篩選能夠分泌特異性的作用于虎杖苷和大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷的酶的菌株---產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株。并對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行分離、純化，命名為根霉T-34。 Ⅱ、通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化根霉T-34的種子培養(yǎng)條件：玉米糖化液50％，麩

5、皮汁6％，生長(zhǎng)因子1.2％，硫酸銨1％，無(wú)機(jī)鹽濃縮液1％。以白藜蘆醇含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定固體發(fā)酵條件為料水比為1：2.5，接種量為25％，發(fā)酵周期36h；利用"復(fù)雜系統(tǒng)反饋調(diào)控技術(shù)"優(yōu)化出虎杖最佳帶渣發(fā)酵條件(孢子接種)，該發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28℃，轉(zhuǎn)速140rpm，固液比例1：10，發(fā)酵72小時(shí)：利用根霉菌絲種子接種大大縮短發(fā)酵周期，發(fā)酵周期為24h；在最佳發(fā)酵條件下，虎杖苷轉(zhuǎn)化率達(dá)98％。 Ⅲ、通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中

6、碳源、氮源、菌體量、β-葡萄糖苷酶酶活、虎杖苷，大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷，白藜蘆醇和大黃素含量的變化，探討影響兩種苷轉(zhuǎn)化的主要因素及其動(dòng)力學(xué)的基本特征。進(jìn)而為發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)控制和發(fā)酵規(guī)模的擴(kuò)大提供重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)。 Ⅴ、建立了從發(fā)酵樣品中分離純化不同純度白藜蘆醇的工藝以及用化學(xué)法提取大黃素。發(fā)酵渣用乙醇提取，得到的粗品中白藜蘆醇得率0.87％，大黃素得率為2.25％；發(fā)酵液中白藜蘆醇采用大孔吸附樹(shù)脂法分離，分離提取條件