誘導E14小鼠ESC分化為小腸上皮細胞的實驗研究.pdf

1、各種原因引起的小腸上皮形態(tài)和功能受損，導致嚴重的消化吸收不良；以及遷延不愈的腸瘺和Crohn’s病是內(nèi)外科臨床面臨的棘手問題。小腸移植，全胃腸外營養(yǎng)，應用生長激素等傳統(tǒng)的治療方法有一定療效，但存在供體匱乏，免疫排斥，高額的費用，療效欠佳等方面的限制。新的治療途徑正在探索中。 自從1998年Thomson等首次成功分離并建立人胚胎干細胞系，掀起了全球范圍內(nèi)的干細胞研究熱潮。胚胎干細胞(ESC)是一群未分化細胞，可無限增殖并分化為機

2、體的幾乎所有的細胞類型，構建各種組織、器官。所以干細胞替代療法有望成為組織和器官的損傷或功能衰竭的一種有應用前景的治療方法。 目前已經(jīng)證實，胚胎干細胞可在體外被定向誘導分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、造血細胞、肝臟細胞、胰島細胞等多種細胞類型。但是體外誘導胚胎干細胞向腸上皮細胞定向分化的研究進展仍相當緩慢。另外，由于對胚胎發(fā)育過程中基因激活與沉默的機制以及胚層，組織和細胞間的信息網(wǎng)絡知之甚少，因此，如何建立優(yōu)化的體外誘導體系使ESC定

3、向分化，如何獲得大量純化、穩(wěn)定和成熟的目的細胞，仍是干細胞研究的難點。 在特定的體內(nèi)外環(huán)境下胚胎干細胞分化過程中，必然先經(jīng)過若干前體細胞階段。本研究擬以小腸上皮發(fā)育生物學的研究進展為外源因子的選擇依據(jù)，按照小腸上皮干細胞發(fā)育、生長與所在的環(huán)境密切相關的規(guī)律，對體外誘導胚胎干細胞向小腸上皮細胞定向分化的研究領域進行初步探索。在表皮生長因子(EGF)、GlutaMAX-Ⅰ及胰島素等為分化誘導因子的培養(yǎng)液中增加小腸間質(zhì)細胞培養(yǎng)上清，提

4、高誘導的效率和準確性，從而建立有效的誘導ESC定向分化為干細胞的體外培養(yǎng)體系。 目的 本研究按照ESC定向分化的理論和技術，探討體外誘導鼠ESC分化為小腸上皮細胞的可行性，分析小腸間質(zhì)細胞的培養(yǎng)上清液對ESC向小腸上皮細胞分化的影響，為大量獲取用于細胞移植的小腸上皮細胞奠定一定的實驗基礎。 方法 1體外小鼠小腸上皮細胞及間質(zhì)細胞的分離和原代培養(yǎng)，進行細胞形態(tài)學觀察，并根據(jù)培養(yǎng)細胞形態(tài)特征，以及免疫細胞化學

5、染色和免疫熒光染色分別檢測CK18蛋白和Vimentin蛋白的表達、AKP染色定性鑒定原代培養(yǎng)細胞。用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)小腸間質(zhì)細胞，同時收集小腸間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)上清液，并以原代小腸上皮細胞作為實驗陽性對照(原代組)。 2首先體外培養(yǎng)、擴增小鼠ESC細胞系E14；將小鼠ESC細胞系E14在去除重組鼠白血病抑制因子后用懸滴法培養(yǎng)，使其形成擬胚體；然后分別用加入小腸間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)上清液(上清組)和未加小腸間質(zhì)細胞原代培

6、養(yǎng)上清液(非上清組)(兩組培養(yǎng)液中均含20％胎牛血清、2mmol/LGlutaMAX-Ⅰ、20ng/mlEGF、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2μg/ml胰島素)分別體外培養(yǎng)16～21d。對不同誘導方案下分化的細胞行細胞形態(tài)學觀察、AKP染色、免疫熒光染色檢測CK18的表達、RT-PCR檢測Msi-1，Hes-1，Cdx2，CK19的mRNA轉錄水平。此外，把不同方案誘導分化的細胞接種到BABL/c裸鼠皮下，觀察其在體內(nèi)

7、形成小腸黏膜細胞能力的。 結果 1倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的小腸上皮細胞，24～48h可見貼壁；4～6d形成一群群的細胞集落；10～12d細胞匯合成片。細胞為圓形、多角形單層生長，呈“鋪路石樣”。細胞漿豐富，核為圓形或卵圓形，含1～2個核仁，核周可見許多小空泡。免疫組化染色后，可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，表達CK18蛋白，陰性對照細胞組細胞未見被染色。以改良Kaplow氏法顯示AKP，細胞表面呈暗黑或灰黑色陽性反應。另免疫熒

8、光染色顯示原代小腸間質(zhì)細胞的胞漿有Vimentin的表達。 2經(jīng)不同誘導的擬胚體，在1W左右的時間都可見上皮樣細胞向周圍生長。2W左右上清組的大部分分化細胞為上皮樣細胞，呈現(xiàn)較好的均質(zhì)性，但是非上清組的分化細胞中還存在較多的成纖維細胞樣細胞等雜細胞生長。繼續(xù)觀察到3W以后，細胞開始死亡、脫落。免疫熒光染色顯示兩組均有大量CK18的表達。AKP染色顯示上清組細胞中AKP染色陽性的細胞(26.9±2.5％)較非上清組(1.2±0.9

9、％)高(P＜0.05)。RT-PCR半定量結果顯示上清組和非上清組的Msi-1和Hes-1mRNA的表達無差別(P＞0.05)，但兩組Msi-1和Hes-1mRNA的表達均高于原代組(P＜0.05)；非上清組Cdx2mRNA的表達低于上清組和原代組(P＜0.05)，上清組的Cdx2mRNA的表達低于原代組(P＜0.05)；原代組與非上清組和上清組的CK19mRNA的表達無差別(P＞0.01)，而非上清組CK19mRNA的表達低于上清組(

10、P＜0.01)。對裸鼠皮下腫物組織切片HE染色后觀察，上清組可見較多的管腔，管腔內(nèi)面可見到明顯的絨毛樣結構，有大量的柱狀上皮細胞和杯狀上皮細胞；非上清組管腔結構較少，組織中可見多種細胞，如軟骨細胞、骨細胞、肌細胞、腺上皮細胞等。腫物組織切片AKP染色后觀察，上清組可見管腔內(nèi)面棕黑色線樣沉淀，為AKP陽性表現(xiàn)；這種現(xiàn)象在非上清組相對少見。 結論 1應用中性蛋白酶Ⅰ和粗膠原酶Ⅺ消化可獲比較純化的上皮細胞。 2應用膠原