胃癌血清蛋白質(zhì)組定量分析及建立差異蛋白決策樹(shù)模型的質(zhì)譜研究.pdf

1、研究目的： 利用SELDI飛行質(zhì)譜與蛋白芯片技術(shù),建立有針對(duì)性的胃癌分類(lèi)決策樹(shù)模型,用于對(duì)胃癌的早期診斷、鑒別及預(yù)后判斷。利用2-D DIGE技術(shù)和MALDITOF/TOF MS對(duì)胃癌、胃潰瘍和正常人血清中的差異蛋白進(jìn)行分離鑒定,尋找潛在的腫瘤標(biāo)記物。 研究?jī)?nèi)容: 第一部分 胃癌患者血清的比較蛋白質(zhì)組研究 實(shí)驗(yàn)一主要是建立胃癌的診斷模型。將所收集的血清樣本包括123例胃癌患者,74例胃良性病,83例正常

2、人血清,分為訓(xùn)練組和盲法測(cè)試組。隨機(jī)選取胃癌組血清標(biāo)本20例,良性胃病13例和正常人血清10例用于盲法驗(yàn)證,其余標(biāo)本作為訓(xùn)練組。 訓(xùn)練組中胃癌103例,對(duì)照組134例(良性胃病61例和正常人血清73例)用以建立分類(lèi)決策樹(shù)模型1;將Ⅰ期胃癌20例,對(duì)照組73例(正常人)用以建立分類(lèi)決策樹(shù)模型2;將Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ胃癌77例,對(duì)照組61例(良性胃病)用以建立分類(lèi)決策樹(shù)模型3。 用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立每例樣本的蛋

3、白表達(dá)譜,通過(guò)BioMarker Wizard統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)各組相同M/Z的蛋白質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算,從而篩選出血清差異蛋白。用Biomarker Pattern數(shù)據(jù)挖掘軟件建立分類(lèi)決策樹(shù)模型。 將盲法測(cè)試組中樣本分別帶入上述決策樹(shù)模型進(jìn)行判別,同時(shí)檢測(cè)CEA和CA19-9水平。 實(shí)驗(yàn)二對(duì)不同分期胃癌蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較。將Ⅰ期胃癌20例,對(duì)照組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ胃癌77例用以建立分類(lèi)決策樹(shù)模型4;將Ⅳ期胃癌18例,對(duì)照組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胃癌

4、79例用以建立分類(lèi)決策樹(shù)5。將實(shí)驗(yàn)一盲法驗(yàn)證組中有明確分期的18例胃癌血清標(biāo)本分別帶入分類(lèi)決策樹(shù)4和分類(lèi)決策樹(shù)5,用于盲法驗(yàn)證：將10例術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的血清帶入分類(lèi)決策樹(shù)5,觀察它診斷胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的能力； 第二部分 胃癌患者血清的定量蛋白質(zhì)組研究 收集年齡與性別相匹配的進(jìn)展期胃腺癌、良性胃潰瘍和正常人三組血清樣本,每組各9例。利用層析柱去除高峰度蛋白,用改進(jìn)Bradford法蛋白定量。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,將每組血

5、清樣本混合后分別與Cy3、Cy5染料結(jié)合,內(nèi)標(biāo)為每?jī)山M間半量樣品混合液與Cy2結(jié)合。一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE后,用Typhoon9410掃描儀在488/520nm,532/580nm,633/670nm波長(zhǎng)分別對(duì)Cy2,Cy3,Cy5熒光染料標(biāo)記的三塊膠圖像進(jìn)行掃描,掃描儀收集的數(shù)據(jù)由DeCyder軟件和人工分析結(jié)合,比較并發(fā)現(xiàn)兩組之間的差異蛋白。重新制備膠雙向電泳、考染并掃描后所得到的膠圖與2-D DIGE圖像對(duì)比,找到制

6、備膠上對(duì)應(yīng)的差異點(diǎn),酶切后采用肽序列標(biāo)簽法對(duì)這些差異蛋白進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。 研究結(jié)果: 第一部分 1.檢測(cè)103例胃癌患者、對(duì)照組61例良性胃病患者和73例正常人血清中的差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進(jìn)行分組,建立了以20個(gè)差異蛋白組成的分類(lèi)樹(shù)模型1,在測(cè)試模式下進(jìn)行分組,對(duì)胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為78.6％(81/103)、80.6％(108/134)。利用43例未知血清樣本進(jìn)行盲法檢測(cè),對(duì)胃癌診斷的敏感性為80.

7、0％,特異性為78.2％,3例I期胃癌中有1例被檢出。敏感性指標(biāo)優(yōu)于同組樣本的CEA和CA19-9檢測(cè)結(jié)果。 2.檢測(cè)20例I期胃癌,73例正常人血清中的差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進(jìn)行分組,建立了以2個(gè)差異蛋白組成的分類(lèi)樹(shù)模型2;在測(cè)試模式下進(jìn)行分組,對(duì)I期胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為95.0％(19/20)、89.0％(65/73)。盲法檢測(cè)26例未知血清樣本,3例I期胃癌全部被檢出。 3.檢測(cè)77例II、II、IV期胃

8、癌患者與61例良性胃病患者,在學(xué)習(xí)模式下進(jìn)行分組,建立了以9個(gè)差異蛋白組成的分類(lèi)決策樹(shù)模型3。在測(cè)試模式下進(jìn)行分組,對(duì)胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為84.4％(65/77)、73.8％(45/61)。對(duì)28例未知血清樣本(II、Ⅲ和IV期胃癌和良性胃病)進(jìn)行盲法檢測(cè),對(duì)胃癌診斷的敏感性為80.0％,特異性為69.2％。 4.檢測(cè)20例I期與77例II、Ⅲ、IV期胃癌患者血清差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進(jìn)行分組,建立了5個(gè)差異蛋白組成的

9、分類(lèi)決策樹(shù)模型4,在測(cè)試模式下對(duì)上述樣本進(jìn)行分組,其準(zhǔn)確率為91.8％(89/97)。對(duì)18例未知血清樣本進(jìn)行盲法檢測(cè),其分組的準(zhǔn)確率為83.3％。 5.檢測(cè)79例I、II、Ⅲ期與18例IV期胃癌患者血清差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進(jìn)行分組,建立了以6個(gè)差異蛋白組成的分類(lèi)決策樹(shù)模型5,在測(cè)試模式下對(duì)上述樣本進(jìn)行分組,其準(zhǔn)確率為92.8％(90/97)。對(duì)18例未知血清樣本進(jìn)行盲法檢測(cè),其分組的準(zhǔn)確率為88.9％。對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的10例

10、血清樣本進(jìn)行盲法檢測(cè),9例被判別為IV期胃癌。 第二部分 胃癌、胃潰瘍和正常人三組樣品兩兩比較,共發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。成功鑒定了其中的9個(gè)蛋白質(zhì)。正常人和胃潰瘍兩組中有三個(gè)在胃潰瘍患者的血清中低表達(dá)的蛋白質(zhì),兩個(gè)蛋白被鑒定,包括結(jié)合珠蛋白2-α和一種未命名蛋白質(zhì)；胃潰瘍和胃癌兩組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)下調(diào)的差異蛋白質(zhì):RAN結(jié)合蛋白2樣因子1亞型1(RAN-binding protein 2-like 1 isoform 1

11、);在胃癌與正常人兩組中共有10個(gè)蛋白質(zhì)差異點(diǎn),在胃癌患者血清中上調(diào)的有6個(gè),下調(diào)的有4個(gè)。成功鑒定了6個(gè)蛋白質(zhì)。四種蛋白質(zhì),包括血清類(lèi)粘蛋白1、載脂蛋白前體、肉豆蔻酸和三碘苯甲酸人血清白蛋白復(fù)合物和肉豆蔻酸人血清白蛋白復(fù)合物在胃癌血清中高表達(dá)。視黃醛及其載體TTR復(fù)合物的D鏈和一個(gè)未命名蛋白質(zhì)在胃癌血清中低表達(dá)。 結(jié)論: 1.成功獲得了以IMAC30 Cu2+固定金屬親合捕獲蛋白芯片和SELDI TOF-MS為基礎(chǔ)的胃

12、癌血清蛋白質(zhì)譜圖并由此建立了相關(guān)的分類(lèi)決策樹(shù)模型, 2.交叉驗(yàn)證和盲法檢測(cè)結(jié)果表明所建立的模型具有較好的靈敏度和特異性,有助于胃癌的診斷,分期,術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測(cè)。 3.建立有較強(qiáng)針對(duì)性的胃癌血清蛋白質(zhì)譜決策樹(shù)模型可以提高診斷的準(zhǔn)確性。 4、與傳統(tǒng)標(biāo)記物相比,SELDI TOF-MS技術(shù)在胃癌的診斷及篩選腫瘤標(biāo)志物等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。 5.利用2-D DIGE技術(shù)和MALDI TOF/TOF MS,成功的鑒