人脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)特性的觀察和一步法凍存細(xì)胞的可行性研究.pdf

1、背景：人脂肪干細(xì)胞(hADSCs)是Zuk PA等[1]于2001年首次從人抽脂術(shù)中脂肪組織懸液中獲得，以其組織來源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小，易體外分離培養(yǎng)、增殖穩(wěn)定，有多向分化潛能等特點(diǎn)[2-5]，為未來科研和臨床提供了廣闊的應(yīng)用前景，成為繼骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)之后又一研究熱點(diǎn)[6]。目前對(duì)于hADSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)特性和凍存、復(fù)蘇細(xì)胞的方法研究較少，極大限制了hADSCs的深入研究和臨床應(yīng)用。
　　 目的：觀察hAD

2、SCs體外培養(yǎng)不同時(shí)期的形態(tài)特征與生長(zhǎng)特性，并對(duì)比探索以-70℃一步法凍存細(xì)胞的可行性。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)hADSCs體外培養(yǎng)中的生長(zhǎng)規(guī)律和細(xì)胞生物學(xué)表型特點(diǎn)，優(yōu)化凍存方法，為以hADSCs為種子細(xì)胞的臨床干細(xì)胞移植研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：于術(shù)中取患者皮下脂肪組織3～5 g，膠原酶消化法體外分離獲取hADSCs，應(yīng)用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基行原代及傳代培養(yǎng)。觀察不同傳代時(shí)期(P1、P3…P15)細(xì)胞形態(tài)特征

3、和生長(zhǎng)特性，檢測(cè)增殖力(細(xì)胞計(jì)數(shù)法)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算群體倍增時(shí)間(PTD)。取生長(zhǎng)良好的P5細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀，采用“排除法”鑒定細(xì)胞表面抗原表達(dá)類型。取處指數(shù)生長(zhǎng)期P5細(xì)胞，利用“10％DMSO+40％FBS+50％DMEM/F12”細(xì)胞凍存保護(hù)液，分別行-70℃一步法凍存及常規(guī)-70℃凍存，于3d和30d后復(fù)蘇細(xì)胞。對(duì)比-70℃一步法凍存及常規(guī)-70℃凍存后復(fù)蘇細(xì)胞的活力(臺(tái)盼藍(lán)拒染法)及培養(yǎng)中的形態(tài)特征和生長(zhǎng)特性，檢測(cè)復(fù)

4、蘇細(xì)胞首次傳代培養(yǎng)后的增殖力(MTT比色法)，且與凍存前細(xì)胞比較。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不一，增殖緩慢；傳代后形態(tài)逐步趨于一致。P1細(xì)胞含有部分異型細(xì)胞，且增值稍緩慢，PTD約75h；P3后細(xì)胞形態(tài)均一，增殖旺盛，PTD約64h；P11后細(xì)胞增殖速度迅速減慢，P13后細(xì)胞呈現(xiàn)衰老特征，PTD約85h。hADSCs表型鑒定提示：CD29、CD44陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45、HLA-DR陰性表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子表

5、達(dá)特點(diǎn)。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存3d及30d后復(fù)蘇細(xì)胞的成活率可達(dá)91％左右，復(fù)蘇后初種植細(xì)胞貼壁時(shí)間較凍存前延長(zhǎng)并伴有少部分細(xì)胞死亡，生長(zhǎng)較緩慢，傳代培養(yǎng)后呈現(xiàn)旺盛增殖，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性與凍存前一致。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存3d及30d后復(fù)蘇細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但與凍存前細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存后復(fù)蘇細(xì)胞傳代培養(yǎng)中增殖力比