ezrin蛋白介導幽門螺桿菌促胃癌侵襲轉(zhuǎn)移作用及其機制初探.pdf

1、胃癌目前仍是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一,轉(zhuǎn)移是腫瘤最具破壞性的本質(zhì),也是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機制對指導治療十分重要。H.pylori感染是胃癌的重要危險因素,世界衛(wèi)生組織已將H.pyori列為Ⅰ類致癌原,對于H.pylori感染對胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移力有無影響,尚存在爭論。H.pylori感染胃癌細胞可使腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵蛋白ezrin蛋白表達及功能發(fā)生變化,H.pylori感染是否能通過影響ezrin及其相關(guān)分子影響

2、胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移,是本課題的需驗證的設(shè)想。
　　 目的:1、明確H.pylori感染與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移是否相關(guān);2、如果二者相關(guān),探討ezrin是否H.pylori感染與與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要的作用;3、初步探討ezrin在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能分子機制,為H.pylori感染促胃癌進展提供新的實驗依據(jù)。
　　 方法:1、利用手術(shù)切除人體胃癌標本,聯(lián)合血清H.pylori抗體檢測及快速尿素酶法檢測H.pylori感染狀態(tài),探討

3、H.pylori感染與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌浸潤深度、病理分型的相關(guān)性;利用H.pylori與胃腺癌細胞AGS體外共培養(yǎng),掃描電鏡觀察H.pylori感染AGS細胞形態(tài)學的改變,transwell小室檢測H.pylori對AGS細胞侵襲力的影響;劃痕實驗觀察H.pylori對AGS細胞遷移力的影響;MTT法檢測H.pylori感染對AGS細胞失巢存活力的影響;2、免疫組化檢測ezrin在胃癌組織中的表達,并探討其表達強弱與胃癌浸潤深度,有

4、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有H.pylori感染的關(guān)系;免疫組化檢測胃癌組織中CD44及E-cadherin的表達,探討與H.pylori感染是否相關(guān)。選取AGS、MKN28、BGC823三種胃癌細胞株,western blot檢測三種細胞株ezrin的表達,transwell小室檢測侵襲力的高低,并探討ezrin表達和侵襲力強弱的關(guān)系;以侵襲力最弱的MKN28細胞株為研究對象,設(shè)立H.pylori感染組與PBS對照組,觀察兩組細胞侵襲力是否有

5、差異,并用western blot檢測ezrin及其相關(guān)蛋白CD44、E-cadhrin的表達和ezrin上游調(diào)控因子Sixl的表達。3、構(gòu)建VIL-2(ezrin編碼基因)的RNA干涉真核表達載體以及陰性對照載體。將干涉載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染侵襲力最強的AGS細胞,經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株AGSezrin。半定量RT-PCR及western blot檢測沉默效應。分別將AGS+PBS、AGS+H.pylori、AGSezri

6、n+PBS、AGSezrin+H.pylori四組細胞為研究對象,掃描電鏡細胞觀察形態(tài)特征的變化,通過MTT、侵襲小室實驗、細胞遷移實驗、黏附實驗觀察細胞的失巢存活、侵襲和遷移、黏附能力。Western blot檢測ezrin、E-cadherin、CD44表達的變化。
　　 結(jié)果:1.①103例患者中,血清抗H.pylori抗體陽性71例,快速尿酶法陽性67例,二者均陽性60例,二者均陰性23例。共83例患者入組,H.pylo

7、ri陽性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例(60％),H.pylori陰性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例(21.7％),H.pylori陽性患者與H.pylori陰性患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著差異(p＜0.05);H.pylori感染與腫瘤浸潤深度評分無關(guān)(p＞0.05),腸型胃癌45例,其中H.pylori陽性率為75.6％(34/45),高于彌漫型胃癌癌灶H.pylori陽性率為42.1％(16/38),差異顯著(p＜0.05)。②H.pylori與AGS細胞

8、共培養(yǎng),觀察到細胞變形,相互分散,出現(xiàn)“蜂鳥表型”及空泡樣變。電鏡下觀察H.pylori感染AGS細胞24小時,細胞變?yōu)殚L梭形,伸出細長偽足。③AGS細胞與H.pylori共孵育后行transwell實驗,每200倍鏡視野下穿膜細胞數(shù)130.4±11.5,高于PBS對照組87.1±9.3,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。④遷移實驗中加入H.pylori的AGS細胞遷移距離均明顯大于PBS對照組細胞。⑤H.pylori感染的細胞失巢培

9、養(yǎng)24小時,細胞生存率高于PBS對照組(P＜0.05)。2.①H.pylori陽性患者胃癌組織中ezrin蛋白表達強度高于H.pylori陰性患者(P＜0.05),ezrin蛋白與胃癌浸潤深度無關(guān)(P＞0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胃癌組織ezrin的免疫活性顯著強于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P＜0.05),H.pylori感染與胃癌組織中CD44表達無關(guān)(P＞0.05),H.pylori陽性患者較H.pylori陰性患者胃癌組織中E-cad

10、herin蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。②檢測三種細胞系侵襲力,侵襲力最強的是AGS,其次為BGC823,最弱為MKN28。Ezrin蛋白在三種細胞系中表達從高到低依次為AGS,BGC823,MKN28,在此三種細胞系中,ezrin的表達強弱與侵襲力高低一致。③以侵襲力最弱的MKN28為研究對象,加入H.pylori的感染組細胞,24小時穿膜數(shù)量為51.5±5.5,加入同體積的PBS的陰性對照組細胞,24小時穿膜數(shù)量為32.7±6.

11、2。二者比較,H.pylori感染組顯著多于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),④H.pylori對MKN28細胞侵襲力的促進作用大于對AGS細胞的作用(P＜0.05)。H.pylori感染促進MKN28細胞中ezrin、CD44蛋白表達,且差異顯著(P＜0.05,P＜0.05)降低E-cadherin在MKN28中的表達(P＜0.05),增加ezrin上游調(diào)控蛋白sixl的表達。3、①成功構(gòu)建針對ezrin轉(zhuǎn)錄基因(VIL

12、2)的3種特異性干擾質(zhì)粒,通過western blot及RT-PCR篩選感染效果最強的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染侵襲力最強、ezrin表達最高的AGS細胞,經(jīng)G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該感染質(zhì)粒的AGSezrin細胞系:②掃描電子顯微鏡觀察細胞表面形態(tài)學變化,AGS細胞呈橢圓形或長梭形,細胞表面粗糙,分布粗短的葉狀偽足;加入100:1(細菌/細胞)H.pylori后,可見H.pylori黏附于細胞表面,細胞表面粗短突起減少,但細胞沿長軸伸出兩細長突起,長度

13、大于2倍細胞直徑,AGSezrin細胞呈多邊形或類圓形,細胞表面向四周伸出較多細長絲狀偽足,可見較豐富的細胞間連接,亦見凋亡細胞;加入100:1(細菌/細胞)H.pylori后,細胞表面幾乎被黏附的Hpylori覆蓋,細胞仍呈多邊形,細胞向周邊輻射狀伸出絲狀偽足。掃描電鏡放大4000倍,AGS表面黏附的H.pylori數(shù)量為:24.2±11.5,AGSezrin細胞表面黏附的H.pylori數(shù)量為:51.4±13.1,顯著多于AGS細胞

14、(P＜0.05);③AGS細胞的黏附率為(76.2±11.7)％,AGSezrin細胞的黏附率為(90.5±7.6)％,二者比較(P＜0.05),差異顯著,10:1比例H.pylori感染AGS及AGSezrin細胞,黏附率分別為(61.8±8.5)％,(92.4±7.3)％,H.pylori感染AGS組細胞黏附率與AGS組比較,顯著下降(P＜0.05);⑤侵襲實驗中200倍鏡下平均每視野AGSEzrin細胞的跨膜數(shù)為27.67±4.5

15、0,與AGS細胞125.50±8.33比較差異顯著(P＜0.05),AGSezrin細胞+H.pylori,跨膜細胞數(shù)為31.25±6.10,與AGSEzrin細胞比較,無顯著差異;AGSezrin的遷移距離明顯小于AGS細胞的遷移距離。而H.pylori感染對AGSezrin細胞遷移無明顯影響;H.pylori感染的AGSezrin細胞在失巢生存率略低于PBS對照組,但無顯著性差異(P＞0.05);⑥H.pylori感染增加AGS細胞