兩株密度感應(yīng)淬滅新菌的分類鑒定及其相關(guān)特性研究.pdf

1、密度感應(yīng)(quorum sensing,QS)是廣泛存在于細(xì)菌中的一種交流方式,通過(guò)信號(hào)分子的產(chǎn)生、積累與應(yīng)答調(diào)控細(xì)菌的一系列生理活動(dòng)。N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones, AHLs)是革蘭氏陰性細(xì)菌中的信號(hào)分子,與許多病原菌的致病性密切相關(guān)。密度感應(yīng)淬滅(quorum quenching, QQ)指通過(guò)信號(hào)分子降解酶或小分子抑制物干擾細(xì)菌的密度感應(yīng),在不殺死細(xì)菌的情況下特異性阻斷致病菌毒力基因的表

2、達(dá),這一方式為解決由于抗生素濫用而產(chǎn)生的細(xì)菌抗藥性等一系列難題提供了新思路。因此,發(fā)現(xiàn)新的具有密度感應(yīng)淬滅活性的細(xì)菌以及新的密度感應(yīng)淬滅物質(zhì)對(duì)于發(fā)展環(huán)境友好型病害防治手段,實(shí)現(xiàn)海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本論文利用多相分類學(xué)方法對(duì)兩株具有密度感應(yīng)淬滅活性的新菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分類鑒定,對(duì)具有強(qiáng)密度感應(yīng)淬滅活性的菌株Th78T進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定與分析并對(duì)該菌株中的密度感應(yīng)淬滅酶進(jìn)行了重組表達(dá),為這兩株密度感應(yīng)淬滅細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)

3、中的后續(xù)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
　　菌株Th78T分離自健康養(yǎng)殖牙鲆腸道,為革蘭氏陰性、好氧、產(chǎn)生黃色色素的短桿狀細(xì)菌,能夠降解AHL信號(hào)分子。基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示菌株Th78T與擬桿菌門黃桿菌科中Flaviramulus basaltis H35T的相似性最高(96.70％)。該菌株不產(chǎn)生flexirubin型色素,能夠進(jìn)行滑行運(yùn)動(dòng)。其最主要的脂肪酸成分為iso-C15:03-OH、iso-C1

4、5:1 G和 iso-C17:03-OH;主要的極性脂為磷酯酰乙醇胺、一種未鑒定的氨基脂以及三種未鑒定的極性脂;主要的呼吸醌成分為甲基萘醌-6(MK-6)。菌株Th78T的DNA G+C含量為31.5 mol%?；谝陨隙嘞喾诸悓W(xué)結(jié)果,菌株 Th78T被認(rèn)為是黃枝菌屬的一個(gè)新種并命名為牙鲆腸黃枝菌(Flaviramulus ichthyoenteri sp. nov.)。
　　另外一株對(duì)C6-HSL降解能力較弱的菌株T202T分離

5、自健康養(yǎng)殖牙鲆的鰓,該菌株為革蘭氏陰性、好氧短桿狀細(xì)菌,與γ-變形菌綱科威爾氏菌科菌株Thalassomonas agariperforans M-M1T的16S rRNA基因序列相似性最高(96.58%),其最適生長(zhǎng)條件為28 oC、2~4%(w/v) NaCl以及 pH7.0–8.0。主要脂肪酸為C16:0、C16:1ω7c and/or C16:1ω6c以及C16:1ω9c;主要呼吸醌為泛醌-8(Q-8);主要的極性脂為磷酯酰乙醇

6、胺和磷脂酰甘油。菌株 T202T的 DNA G+C含量為37.0 mol%?；谝幌盗羞z傳學(xué)特征及表型特征的鑒定結(jié)果,菌株T202T被確定為科威爾氏菌科深海短桿菌屬的一個(gè)新種,并被命名為魚深海短桿菌(Thalassotalea piscium gen. nov., sp. nov.)。
　　利用Illumina Hiseq2000平臺(tái)對(duì)菌株Th78T的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定。菌株Th78T基因組大小為3,953,230 bp,共預(yù)

7、測(cè)得到3,451個(gè)基因、40個(gè)tRNA以及6個(gè)rRNA。選取已知典型的AHL內(nèi)酯酶序列與菌株Th78T基因組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因組中的兩個(gè)金屬-β-內(nèi)酰胺酶基因可能編碼產(chǎn)生有活性的AHL內(nèi)酯酶。除此之外,菌株Th78T基因組能夠編碼產(chǎn)生一系列消化酶,可能有利于魚類腸道中的消化過(guò)程,同時(shí)菌株Th78T還能夠利用腸道環(huán)境中的多種糖類物質(zhì)如唾液酸等。與另外兩株進(jìn)化關(guān)系較近的黃桿菌科細(xì)菌Gaetbulibacter saemankumensis

8、 DSM17032T和Lacinutrix sp.5H-3-7-4基因組序列的比較結(jié)果顯示,菌株 Th78T在糖類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝方面與這兩株菌存在明顯的不同。
　　對(duì)菌株Th78T中可能的AHL內(nèi)酯酶基因GL001211在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá),得到了有活性的蛋白并將其命名為FiaL。該蛋白理論分子量為32.6 kDa,理論等電點(diǎn)為7.58,對(duì)不同鏈長(zhǎng)和側(cè)鏈修飾的 AHL均具有降解能力,與菌株Th78T對(duì)AHL信號(hào)分子的降解特性相符