海參養(yǎng)殖環(huán)境耐藥菌分析及三株海洋新菌的分類鑒定.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從山東省榮成市某海參養(yǎng)殖池(36°54′36″N，122°14′33″E)不同時(shí)間點(diǎn)采集水樣和泥樣。之后利用梯度稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間不同環(huán)境可培養(yǎng)微生物、耐左氧沙星微生物以及弧菌的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，可培養(yǎng)微生物總量會在十月份達(dá)到一個(gè)峰值，然而這個(gè)階段耐藥菌的數(shù)量則相對較少，這可能是由于芽孢桿菌等有益菌的加入而導(dǎo)致的。經(jīng)過表型排重后將菌株分離并保藏，本實(shí)驗(yàn)共得到500余株菌。之后用藥敏紙片法測定了部分菌株的耐藥譜，分析其結(jié)果

2、發(fā)現(xiàn)八月份菌株耐藥性水平最高，微生物對四環(huán)素、萘啶酸、卡那霉素的耐藥性最高。最后用PCR法對166株細(xì)菌進(jìn)行了檢整合子檢測，49株來自海參養(yǎng)殖池樣品，Ⅰ型整合子陽性菌株2株，陽性率4.1％;其余117株來自入水口或海井環(huán)境，Ⅰ型整合子陽性菌株10株，陽性率為8.5％。
　　實(shí)驗(yàn)過程中還用16S rRNA基因測序的方法對分離到的部分菌株進(jìn)行了鑒定，對其16S rRNA基因相似度較低的三株海洋細(xì)菌(HS6T、FA350T、XK5T)進(jìn)

3、行了多相分類鑒定。
　　HS6T是一株革蘭氏陰性，棒狀、弧形或者螺旋形，氧化酶、過氧化氫酶陽性，兼性厭氧的新菌，分離自黃海沿海底泥樣品。可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，可以在2216E培養(yǎng)基上生長，最適生長條件為:30-33℃，鹽度2-3％(w/v)，pH6.5-7.0。基于16S rRNA基因序列的發(fā)育分析表明，與之最相近的菌株為南極海神單胞菌(Neptunomonas antarctica)，相似度為93.3％;緊隨其后的是日本海神

4、單胞菌(N.japonica)和伴根海洋桿菌(Marinobacterium rhizophilum)，相似度分別為93.2％和93.1％。菌株HS6T的極性脂由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油還有其它一些未知成分的脂質(zhì)組成。主要的脂肪酸是summed feature3(C16∶1ω7c/iso-C15∶02-OH)，C18∶1ω7c以及C16∶0;主要的呼吸醌為泛醌Q-8;基因組G+C含量為為61.2 mol％?；诜肿影l(fā)育分析、生理生化以及

5、化學(xué)組分分析的結(jié)果表明，菌株HS6T代表了分類學(xué)上的一個(gè)新種新屬，建議將其命名為底泥運(yùn)動單胞菌(Motiliproteus sediminis)。模式菌株為HS6T(=ATCC BAA-2613T=CICC10858T)。
　　FA350T是一株革蘭氏陰性，棒狀，有滑動性，兼性厭氧，氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性的新菌，分離自威海海域底泥樣品。FA350T在加入了0.1％D型海藻糖(D-trehalose)，并用海水代替蒸餾水的營養(yǎng)培

6、養(yǎng)基上長勢良好。最適生長條件為33℃，pH8.5，鹽度4％?；?6S rRNA基因序列的分子進(jìn)化發(fā)育分析表明，F(xiàn)A350T代表了德爾塔變形菌綱下一個(gè)新目級別的分類單元，最相近的菌株屬于除硫單胞菌目（Desul furomonadales），序列相似性在85.1-85.6％之間。極性脂由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及其它兩種未知的磷脂組成;主要的脂肪酸為iso-C15∶0，iso-C17∶0和iso-C17∶1ω10c;甲基奈醌MK-7是

7、唯一的呼吸醌;菌株基因組G+C含量為60.3 mol％。菌株FA350T以及其它一些相近的未培養(yǎng)微生物的16S rRNA序列在德爾塔變形菌綱下形成了一個(gè)新目級別的分支。比較分析16SrRNA基因序列表明，F(xiàn)A350T很可能代表了德爾塔變形菌綱下的一個(gè)新目。在此基礎(chǔ)上，提出建立一個(gè)新的分類單元——慢生單胞菌目(Bradymonadales ord.nov.)以容納這一從未被別人描述過的新物種，慢生單胞菌目前只包含一個(gè)科——慢生單胞菌科(B

8、radymonadaceae fam.nov.)，模式屬是慢生單胞菌屬(Bradymonas gen.nov.)，模式種為底泥慢生單胞菌(Bradymonas sediminis gen.nov.，sp.nov.)，模式菌株為FA350T(=DSM28820T=CICC10904T)。
　　XK5T是一株革蘭氏陰性菌株，細(xì)胞呈棒狀或彎曲棒狀，兼性厭氧，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，分離自威海海域底泥樣品。它有很強(qiáng)的適應(yīng)性，可以很好的

9、適應(yīng)比較惡劣的條件。最優(yōu)生長條件為28-35℃，pH7.0-8.0，鹽度1-3％(w/v)?；?6S rRNA基因序列的進(jìn)化分析顯示，與其相似性最高的物種為硫氰酸脫氮硫堿弧菌(Thioalkalivibrio thiocyanodenitrificans)，相似度92.1％;其次是這一屬的另外兩個(gè)物種，嗜硫硫堿弧菌(T.sulfidiphilus)和脫氮硫堿弧菌(T.denitrificans)，相似度分別為91.9和91.8％;這三

10、株是僅有的與XK5T16S rRNA基因序列相似度大于91％的物種。極性脂主要由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及其它一些未知的磷脂、氨基脂以及脂質(zhì)組成;主要的脂肪酸由iso-C17∶1ω9c和iso-C15∶0組成;主要的呼吸醌是泛醌Q-8;基因組G+C的含量為59.3 mol％。綜合比較16S rRNA基因序列表明，XK5T是外硫紅螺菌科下的一個(gè)新屬。建議將其命名為海洋沃斯菌(Woeseia oceani gen.nov.，sp.nov.