柄海鞘、海膽可培養(yǎng)共附生微生物多樣性研究及三株海洋新菌的分類鑒定.pdf

1、通過純培養(yǎng)和16SrRNA基因序列的相似性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)威海海域柄海鞘(Styelaclava)、馬糞海膽（Hemicentrotuspulcherrimus）可培養(yǎng)共附生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究。用2216E培養(yǎng)基從柄海鞘、海膽樣品中分別分離到78和113株細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)特征和TCBS培養(yǎng)基選擇性篩選后，分別選取30、31株具有代表性的菌株進(jìn)行了16SrRNA基因測序和基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。結(jié)果表明

2、，柄海鞘30株細(xì)菌分別屬于細(xì)菌域的4個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類群(Actinobacteria，Bacteroidetes，F(xiàn)irmicute，Proteobacteria)的13個(gè)科，13個(gè)屬。其中菌株HQW7、HQYD1、HQWD4、HQE1和HQE2與相關(guān)模式菌株的16SrRNA基因相似度較低，初步推斷這5株菌可能代表新的分類單元。分離自海膽的31株細(xì)菌分別屬于細(xì)菌域的4個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類群(Actinobacteria,Bacteroide

3、tes,Firmicutes，Proteobacteria)的13個(gè)科，14個(gè)屬。經(jīng)16SrRNA基因序列分析，菌株HD4、HD13、YD24可能是海洋細(xì)菌新種。柄海鞘和馬糞海膽共附生細(xì)菌中γ變形菌綱的菌是優(yōu)勢菌群，占所分離細(xì)菌總數(shù)的50％以上。研究表明威海海域柄海鞘、馬糞海膽共附生細(xì)菌存在著較為豐富的物種多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性，并存在新的物種。
　　 在對(duì)馬糞海膽共附生細(xì)菌多樣性研究中，基于16SrRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)從海

4、膽體腔液中分離的菌株HD4為需鹽桿菌屬（Salegentibacter）的細(xì)菌新種，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征研究表明HD4為革蘭氏陰性，專性好氧菌，無鞭毛無運(yùn)動(dòng)性，在2216E培養(yǎng)基上形成黃色菌落。最適生長條件是:28-30℃，pH7.5-8.3，3-5％(w/v)NaCl。DNA(G+C)mol％含量是37.0％。主要脂肪酸有iso-C15∶0,iso-C17∶03-OH和summedfeature3(iso-C15∶02OH/C16

5、∶1ω7c)?；谝陨涎芯?，將HD4命名為海膽需鹽桿菌Salegentibacterechinorum。模式菌株是HD4T(=CICC10466T=NRRLB-59666T)。HD4T16SrRNA基因序列的GenBank收錄號(hào)是JN040280。
　　 以同樣的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存菌株J221和H5也進(jìn)行了分類鑒定。J221是革蘭氏陰性、氧化酶陽性、好氧桿菌，有一至幾根極生鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性。最適生長條件:25-28℃，pH7.5-

6、8.0，2-3％(w/v)NaCl。細(xì)胞脂肪酸包括summedfeature3(C16∶1ω7c/C16∶1ω6c)，C16∶0和C18∶1ω7c。基因組DNA(G+C)mol％含量是46.8％?；?6SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明J221屬于γ-變形菌綱，但是與目前已發(fā)表屬的相似性＜91％。因此我們認(rèn)為J221應(yīng)該代表一個(gè)新屬，命名為奈爾菌屬Neiella。模式菌種是J221T(=CGMCC1.10130T=NRRLB-513

7、19T)，命名為海洋奈爾桿菌Neiellamarinum。J221T的16SrRNA基因序列的GenBank收錄號(hào)是EU513001。
　　 H5是革蘭氏陽性、無芽孢、不運(yùn)動(dòng)的直桿狀或略有彎曲的桿狀菌。最適生長條件是28-30℃，pH7.5-8.0，0-1％（w/v）NaCl。H5的醌類型是MK-9，MK-9(H2)和MK-9(H4)，脂肪酸是C18∶1ω9c，C16∶0，C14∶0，C18∶0和C16∶1ω9c。細(xì)胞壁肽聚糖類

8、型是A5alpha（L-Lys-L-Ala-L-Lys-D-Glu），細(xì)胞極性脂有雙磷脂酰甘油，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇甘露糖苷。基因組DNA(G+C)mol％含量是61.8％?；?6SrRNA基因序列的相似性分析表明H5屬于放線菌科的新屬?；谛螒B(tài)學(xué)、生理生化和分子特征分析，我們認(rèn)為H5代表新屬—黃色彎曲桿菌屬Flaviflexus。模式菌種黃海黃色彎曲桿菌Flaviflexushuanghaiensis是H5T(=DSM