共附生微生物抗腫瘤活性菌的篩選、鑒定及活性產(chǎn)物的研究.pdf

1、癌癥是當(dāng)今危害人類健康的主要疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命。目前醫(yī)學(xué)臨床上常用的大多數(shù)藥物只能使病情緩解，無法達(dá)到完全治愈的目的，所以抗腫瘤新藥的開發(fā)一直是藥物研究領(lǐng)域的主要方面。微生物在自然界物質(zhì)循環(huán)過程中維持著生物圈的動態(tài)平衡，很多微生物和動植物保持著共生或附生的關(guān)系。動植物體內(nèi)的共附生微生物因其所處宿主環(huán)境的不同而顯示出較為獨(dú)特的代謝途徑與生理活性。共附生微生物被認(rèn)為是天然活性產(chǎn)物的重要來源。
　　 本實(shí)驗(yàn)以人宮頸癌HeL

2、a細(xì)胞為篩選模型對分離自海綿和植物組織的一些共附生微生物進(jìn)行抗腫瘤活性菌株的篩選。分別采用了MTT法、SRB法、染料排斥法這三種細(xì)胞毒篩選方法對252株微生物菌株的發(fā)酵提取物進(jìn)行了抗腫瘤活性的篩選，比較了三種方法的篩選結(jié)果，選取了7株具有良好抗腫瘤活性的菌株。重點(diǎn)對一株植物內(nèi)生真菌YX-5進(jìn)行了鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、活性產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究，還通過硅膠柱層析，反相柱層析等分離方法對其活性產(chǎn)物進(jìn)行了分離，通過GC-MS、NMR等手段對主要的活性

3、成分進(jìn)行了鑒定。通過本論文的研究為環(huán)境微生物資源以及抗腫瘤活性物質(zhì)的開發(fā)提供了一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。論文主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)SRB法、MTT法、染料排斥法三種方法篩選表明，252株菌株中有大約28％的測試菌株在提取物濃度為100μg/mL時對HeLa細(xì)胞的抑制率在50％以上，且活性菌株基本一致，具有較好的相關(guān)性。經(jīng)復(fù)篩后確定有6株細(xì)菌和1株真菌具有良好且穩(wěn)定的抗腫瘤活性，其提取物在100μg/mL時對HeLa細(xì)胞的抑制率均

4、在80％以上，其中活性最高的YX-5對HeLa細(xì)胞的IC50達(dá)到了5.33μg/mL。
　　 (2)經(jīng)場發(fā)射掃描電鏡觀察、菌落形態(tài)觀察以及ITSrDNA序列分析，初步鑒定真菌YX-5為米曲霉(Aspergillusoryzae)。
　　 (3)通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間以及搖床轉(zhuǎn)速等條件，以菌體干重，代謝物產(chǎn)量以及抗腫瘤活性為指標(biāo)，確定YX-5的最佳發(fā)酵條件為GPY培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時間7

5、d、適宜pH為7.0、搖床轉(zhuǎn)速110r/min。
　　 (4)以高溫、pH、紫外線和蛋白酶處理下代謝產(chǎn)物的抗腫瘤細(xì)胞活性為指標(biāo)，對YX-5活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，菌株YX-5的代謝產(chǎn)物對紫外線和蛋白酶處理有較高的抗性，在超過100℃或在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性有較大幅度的下降，不過仍然具有一定的抗腫瘤活性，總體來講YX-5的活性物質(zhì)穩(wěn)定性較高。
　　 (5)YX-5經(jīng)規(guī)?；l(fā)酵(25L)、發(fā)酵液乙酸乙酯萃取后，得到

6、粗提物5.15g，將粗提物按極性高低初步分為三部分:正己烷相、二氯甲烷相和65％甲醇水相，經(jīng)SRB法測定，活性組分主要集中在二氯甲烷相。采用薄層層析法選擇分離YX-5活性產(chǎn)物的溶劑體系和溶劑比例，結(jié)果表明，二氯甲烷和甲醇體系適用于YX-5活性產(chǎn)物的分離。在初次的硅膠層析柱時，以甲醇含量分別為2％、10％、20％、100％的氯仿-甲醇洗脫體系進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示活性組分主要集中在10％甲醇洗脫段。經(jīng)兩次ODS反相柱層析后對柱分離產(chǎn)物進(jìn)行