深海熱液口微生物-病毒互作及其次生代謝產(chǎn)物抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的研究.pdf

1、深海熱液口是地球上最極端的環(huán)境之一，具有黑暗、高壓、低氧、缺乏營養(yǎng)以及富含多種礦物質(zhì)等特點。自從上世紀70年代發(fā)現(xiàn)深海熱液口存在獨特的生物群落以來，深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)受到了海洋學(xué)家廣泛的關(guān)注并成為了海洋生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。在深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中，化能自養(yǎng)古菌和細菌利用熱液口環(huán)境中的熱能和化學(xué)能合成有機質(zhì)，為熱液口其他生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，構(gòu)成了深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，對整個熱液口生物群落結(jié)構(gòu)具有調(diào)控作用。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)

2、熱液口病毒具有極高的豐度，病毒可能對微生物以及整個熱液口生物群落結(jié)構(gòu)都具有重要的調(diào)控作用。因此，研究深海熱液口病毒與微生物的相互作用對了解熱液口生態(tài)系統(tǒng)具有十分重要的意義。
　　由于熱液口環(huán)境中溫度和化學(xué)梯度的動態(tài)變化，使得熱液口微生物群落的多樣性和豐度可能存在差異，因此我們首先對東太平洋中脊、南大西洋和西南印度洋海隆深海熱液口硫化物、水體和底棲動物腸道樣本中細菌的多樣性進行分析。細菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，Prot

3、eobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在三大洋深海熱液口中均為優(yōu)勢細菌門類，說明不同海區(qū)熱液口細菌群落結(jié)構(gòu)在優(yōu)勢菌群組成上存在一定程度的共性;但是，三大洋在細菌群落多樣性和豐度方面具有很大的差異性。研究表明，熱液口水體中細菌多樣性要明顯小于硫化物的細菌多樣性，而動物腸道中的細菌多樣性最小。結(jié)果顯示，動物腸道細菌的絕大多數(shù)細菌門類都存在于硫化物細菌中，說明微生物是熱液口底棲動物的主要食物來源，是深海

4、熱液口生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者。
　　通過對深海熱液口細菌群落結(jié)構(gòu)的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)熱液口細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，而病毒與宿主菌之間的相互作用可能是造成這種差異的主要原因，因此我們對深海熱液口病毒與宿主之間的互作進行了進一步研究。根據(jù)傳統(tǒng)方法從環(huán)境樣品中分離病毒需要的樣品量較大，而目前的采樣技術(shù)很難從深海熱液口環(huán)境采集大量樣品并提取到足夠的病毒宏基因組DNA，因此對深海病毒的研究變得尤為困難。在本研究中，我們首先對熱液口樣品的病毒

5、分離以及病毒宏基因組提取技術(shù)進行改進，利用PEG6000處理結(jié)合超高速離心的方法對病毒顆粒進行濃縮，再采用全基因組擴增方法對提取到的病毒宏基因組DNA進行擴增，提高病毒宏基因組DNA的濃度。通過透射電鏡觀察和熒光定量PCR檢測內(nèi)參病毒GVE2拷貝數(shù)等方法，結(jié)果表明采用改進后的病毒分離及病毒宏基因組提取和擴增的方法，病毒分離效率較好，病毒宏基因組DNA濃度可以滿足宏基因組高通量測序的要求。利用改進后的方法，從西南印度洋深海熱液口3個站點的

6、沉積物樣品中，分別獲得了病毒和微生物宏基因組DNA，并進行了高通量測序分析。分析結(jié)果表明，熱液口病毒功能基因和微生物功能基因的分類較為相似，其中與氨基酸運輸與代謝、轉(zhuǎn)錄、無機鹽運輸與代謝、細胞膜和細胞壁代謝和能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)基因等與基因轉(zhuǎn)錄和生物大分子合成代謝相關(guān)基因所占比例較高。在病毒宏基因組中，發(fā)現(xiàn)一類與細胞膜和細胞壁代謝相關(guān)的功能基因，其中包含了與噬菌體裂解相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶、二肽酶和N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，表明在一定的條件下

7、熱液口病毒對微生物具有裂解作用。通過KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)代謝通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒的功能基因不僅參與微生物的代謝過程，而且還存在一些病毒特有的功能基因（如葡糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、羥酰谷胱甘肽水解酶、D-乳酸脫氫酶、乙酸激酶和乙醛脫氫酶等的編碼基因）使得微生物的代謝通路更加完善，對微生物的代謝通路具有一定的補償作用，從而增強了微生物對環(huán)境的適應(yīng)性。本文的研究結(jié)果表明

8、，深海熱液口病毒能夠?qū)嵋嚎谖⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)和代謝過程進行調(diào)控，進而影響整個熱液口生態(tài)系統(tǒng)。
　　通過對深海熱液口微生物與病毒相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，熱液口病毒會影響宿主的代謝過程。微生物在受到病毒侵染的過程中會發(fā)生一系列代謝變化，這與腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)生代謝改變具有一定相似性，因此熱液口病毒感染宿主菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可能具有抗腫瘤活性。由于深海熱液口極端的生態(tài)環(huán)境以及熱液口存在豐富的生物資源，使得熱液口微生物次生代謝產(chǎn)物無論是

9、在分子結(jié)構(gòu)還是生物活性方面都具有獨特性，可能成為抗腫瘤新藥開發(fā)的重要來源。因此，在本實驗室前期研究基礎(chǔ)上，本論文利用熱液口嗜熱噬菌體GVE2感染其宿主菌Geobacillus sp.E263產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，篩選具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的化合物，并深入研究其抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的機制。我們從本實驗前期研究獲得的24種差異代謝產(chǎn)物中選取了6種結(jié)構(gòu)已知的化合物（L-正亮氨酸、鄰氨基對甲苯酚、對羥基苯甲醇、色醇、腺嘌呤和安替比林），研究其對人胃癌和乳

10、腺癌細胞及相應(yīng)正常細胞增殖、遷移、侵襲和粘附能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-正亮氨酸顯著抑制胃癌細胞HGC-27和乳腺癌細胞MDA-B-435的細胞遷移、侵襲和粘附，但對胃和乳腺正常細胞增殖沒有明顯的抑制作用，說明L-正亮氨酸對癌細胞具有較好的選擇性。通過對L-正亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的活性測定，確定了L-正亮氨酸抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的活性基團。通過對L-正亮氨酸進行衍生化，得到了具有腫瘤細胞轉(zhuǎn)移抑制活性的衍生物(3S，6S)-3，6-二丁基哌嗪-2，5

11、-二酮。利用L-正亮氨酸耦聯(lián)溴化氰活化介質(zhì)進行親和下拉試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-正亮氨酸作用的靶蛋白是核內(nèi)不均一核糖核蛋白hnRNPA2/B1。進一步研究顯示，L-正亮氨酸可能通過作用于核內(nèi)不均一核糖核蛋白并上調(diào)E-cadherin的表達，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。
　　本論文圍繞深海熱液口病毒與微生物之間的相互作用展開研究。首先，通過對東太平洋中脊、南大西洋和西南印度洋海隆深海熱液口細菌群落多樣性研究，拓展了對深海熱液口微生物群落結(jié)構(gòu)的認識。其