培養(yǎng)方法對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響及兩株新菌的初步鑒定.pdf

1、提高土壤微生物的可培養(yǎng)性，獲得純培養(yǎng)微生物菌株，是微生物生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前由于技術(shù)手段的限制，以及人類認(rèn)識(shí)水平的不足，使得自然界中微生物總數(shù)的99％還難以用純培養(yǎng)技術(shù)獲得分離和培養(yǎng)。因此研究和開(kāi)發(fā)這99％的未培養(yǎng)微生物已成為國(guó)內(nèi)外的一個(gè)熱點(diǎn)。本論文采用三種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不同的培養(yǎng)基對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行分時(shí)段計(jì)數(shù)，以細(xì)菌通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段，用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切PCR產(chǎn)物，對(duì)酶切圖譜進(jìn)行分型，研究了不同培養(yǎng)方法對(duì)土壤細(xì)菌

2、多樣性和可培養(yǎng)的影響；本論文還對(duì)從土壤中分離得到的兩株與其相鄰菌種具有較大差別的新菌株（標(biāo)記為 TR6-7和TR6-11）進(jìn)行了初步鑒定。
　　 結(jié)果表明，LB、CSEA、WSA培養(yǎng)基192 h后每 g干土獲得的細(xì)菌數(shù)量分別為14.84×107、10.27×107和6.91×107 CFU，但微生物多樣性指數(shù)以WSA為最高，LB多樣性指數(shù)最低；三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌菌群有一定的相似性，LB和CSEA培養(yǎng)基間的Jaccard指數(shù)為5

3、7.69％，LB和WSA培養(yǎng)基之間為53.13％，而CSEA和WSA培養(yǎng)基的相似性指數(shù)達(dá)66.67％；96～192 h細(xì)菌的豐富度最高，0～48 h細(xì)菌豐富度最低，并且三種培養(yǎng)基中單一OTUs類型的43.9％均是在96 h后才出現(xiàn)的。16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群在分類方面主要屬于γ-和β-變形桿菌以及放線菌亞門，其中某些OTUs中的16S rDNA序列與 Burkholderiaceae bacterium、R

4、hodococcus和Mycobacterium屬具有較高的同源性，推測(cè)其細(xì)胞能夠分泌復(fù)蘇促進(jìn)因子，有效地提高土壤細(xì)菌的可培養(yǎng)性。
　　 TR6-7革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性，細(xì)胞形態(tài)呈橢圓狀，無(wú)鞭毛和菌毛；最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH值為6.08，最適的鹽濃度為2％，無(wú)Nacl等鹽離子依賴性。TR6-7菌株不能使明膠液化，不能使淀粉水解，V.P.實(shí)驗(yàn)為陰性，不能使甲基紅變紅，不產(chǎn)生氨氣，不產(chǎn)生吲哚，但能產(chǎn)生H2S，能使過(guò)氧化氫溶液

5、產(chǎn)生小氣泡，能使硝酸鹽還原。TR6-7能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麥牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖為唯一碳源生長(zhǎng)，但不利用甘露醇和甜醇。TR6-7的主要脂肪酸為C22:1 w7c/22:3 w3c。TR6-7的16S rDNA序列與其最相鄰Phycicoccusdokdonensis KCTC19248T的同源性為97.2％。基于以上數(shù)據(jù)我們初步鑒定菌株TR6-7屬于Phycicoccus屬的一個(gè)新

6、種，并命名為Phycicoccus sp.TR6-7。
　　 TR6-11革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)桿狀，無(wú)鞭毛和菌毛，無(wú)運(yùn)動(dòng)能力，好氧；在GPM、NA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適的鹽濃度為0.5％，無(wú)Nacl等鹽離子依賴性，最適pH值為6.8.V.P.實(shí)驗(yàn)為陰性，不能使甲基紅變紅，不產(chǎn)生氨氣，不產(chǎn)生吲哚，不能水解Tweens40，80，但能水解Tweens20.TR6-11能產(chǎn)生H2S，能使明膠液化，能

7、使淀粉水解，能使過(guò)氧化氫溶液產(chǎn)生小氣泡，能使硝酸鹽還原。能利用蔗糖、半乳糖、果糖、麥牙糖、山梨醇、阿拉伯糖、蜜三糖、核糖、乳糖、甘露糖、肌醇、葡萄糖、木糖、甘露醇、甜醇、鼠李糖為唯一碳源生長(zhǎng)。TR6-11的主要脂肪酸為C22:1 w7c/22:3 w3c，C24:2 w6c。TR6-11的16S rDNA序列與最其相鄰的Humihabitans NRRL B-24470T同源性為97.1％.基于以上數(shù)據(jù)我們初步鑒定菌株TR6-11屬于H