鈉鉀ATP酶α1亞單位在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、目的:本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞,探討天然鈉鉀ATP酶抑制劑華蟾酥毒基和鈉鉀ATP酶α1亞單位基因沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響,觀察鈉鉀ATP酶下游相關(guān)信號(hào)途徑分子基因的表達(dá)變化,探討鈉鉀ATP酶α1亞單位在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的作用。
　　 方法:(1)靶向鈉鉀ATP酶α1亞單位shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選:設(shè)計(jì)、合成靶向人鈉鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1(ATP1A1)mRNA的3對(duì)

2、DNA序列,分別插入Pgenesil-3中構(gòu)建編碼ATP1A1的短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體shRNA-ATP1A1(ATP1A11,ATP1A12和ATP1A13),經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序鑒定確認(rèn)。篩選并確定最佳細(xì)胞接種量及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量,半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)Na+/K+-ATPaseα1表達(dá)變化,從而確定沉默效果最明顯的shRNA-ATP1A1。(2)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉

3、默效果最明顯的ATP1A13和華蟾酥毒基對(duì)HepG2增殖活性和細(xì)胞周期的影響。(3)形態(tài)學(xué)觀察:倒置光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后的細(xì)胞形態(tài)。(4)RT-PCR檢測(cè)ATP1A13和華蟾酥毒基作用于HepG2細(xì)胞不同時(shí)間,CDK2,PCNA,eyclinA,p21,p53,c-src,Raf1,MEK1,MEK2,ERK,c-Myc mRNA的表達(dá)變化。(5)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)ATP1A13和華蟾酥毒基作

4、用于HepG2細(xì)胞24 h后各基因mRNA的表達(dá)變化。(6)Western blot檢測(cè)ATP1A13和華蟾酥毒基對(duì)CDK2,PCNA,CyclinA,p53,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:(1)質(zhì)粒構(gòu)建及篩選:構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體酶切鑒定均可擴(kuò)增出預(yù)期條帶,經(jīng)測(cè)序符合設(shè)計(jì)要求,構(gòu)建成功。ATP1A12和ATP1A13對(duì)所轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中Na+/K+-ATPaseα1 mRNA和蛋白

5、表達(dá)均有抑制作用,其中ATP1A13最為明顯。實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)ATP1A13敲低HepG2 Na+/K+-ATPaseα1 mRNA呈時(shí)間依賴性,72 h后表達(dá)降低約90％。(2)生長(zhǎng)抑制作用:ATP1A13和華蟾酥毒基均可抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染試劑和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制不明顯。華蟾酥毒基對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間濃度依賴性,高濃度的華蟾酥毒基(10μmol/L)對(duì)細(xì)胞抑制顯著,而低濃度(0.01

6、μmol/L)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用明顯降低。經(jīng)直線回歸計(jì)算,24 h,48 h,72 h IC50分別為(3.039±0.371)、(0.758±0.102)和(0.133±0.028)μmol/L。(3)細(xì)胞周期改變:ATP1A13和華蟾酥毒基都可使HepG2細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯。轉(zhuǎn)染48 h和60 h,S期細(xì)胞由正常的(27.60±1.98)％升至(39.4±2.04)％和(50.2±1.95)％。華蟾酥毒基作用于HeoG2細(xì)胞6、

7、12、18和24 h,S期細(xì)胞比例分別為(32.51±2.34)％、(40.28±1.89)％、(55.27±1.98)％和(67.28±1.92)％,均高于正常對(duì)照。ATP1A13和華蟾酥毒基作用后,HepG2細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CDK2,CyclinA,PCNA)的含量減少,細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21CIP1表達(dá)上升。(4)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:HepG2為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞,ATP1A13和華蟾酥毒基作用后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。AT

8、P1A13轉(zhuǎn)染24 h,部分細(xì)胞變圓腫脹,貼壁狀態(tài)不好;轉(zhuǎn)染36 h,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂有少量漂浮細(xì)胞;轉(zhuǎn)染48和60 h時(shí),絕大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象,細(xì)胞間失去正常的接觸抑制,細(xì)胞碎片增多;轉(zhuǎn)染72 h時(shí),細(xì)胞大都破碎、死亡。1μmol/L華蟾酥毒基作用6 h即可見有細(xì)胞腫脹變圓;隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),腫脹細(xì)胞逐漸增多;華蟾酥毒基作用24 h后,細(xì)胞間間隙變大,細(xì)胞破碎變形、排列紊亂。熒光顯微鏡下可見ATP1A13轉(zhuǎn)染和華蟾酥毒基

9、作用后部分細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則,核染色質(zhì)凝集,核膜破裂等細(xì)胞形態(tài),且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),上述改變更加明顯。(5)ATP1A13和華蟾酥毒基對(duì)HepG2細(xì)胞信號(hào)途徑分子基因mRNA表達(dá)的影響:ATP1A13轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,MEK1,MEK2,ERK和c-Myc mRNA的表達(dá)下調(diào);p53,c-src和Rafl mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。華蟾酥毒基作用后,HepG2細(xì)胞Rafl和ERK mRNA的表達(dá)上調(diào);MEK1和c-Myc mRNA的

10、表達(dá)顯著上調(diào);p53和c-src mRNA的表達(dá)下調(diào)。(6)ATP13和華蟾酥毒基對(duì)HepG2細(xì)胞信號(hào)途徑分子基因蛋白表達(dá)的影響:ATP1A13作用于HepG2細(xì)胞后,與對(duì)照組細(xì)胞相比,c-Src,ERK,p-ERK和c-Myc蛋白表達(dá)下調(diào),p53蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。華蟾酥毒基可以下調(diào)HepG2細(xì)胞c-Src,p-ERK和c-Myc蛋白的表達(dá),上調(diào)p53的表達(dá)。
　　 結(jié)論:(1)成功構(gòu)建靶向鈉鉀ATP酶α1亞單位基因沉默的質(zhì)粒

11、表達(dá)載體,并篩選出抑制效果最佳的表達(dá)載體ATP1A13。(2)ATP1A13和華蟾酥毒基作用于HepG2后,可以降低周期蛋白復(fù)合體(CyclinA/CDK2/PCNA complex)的含量,并上調(diào)p21CIP1的表達(dá),使細(xì)胞周期發(fā)生S期阻滯。(4)應(yīng)用ATP1A13和華蟾酥毒基處理HepG2細(xì)胞,可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá),下調(diào)c-Src和p-ERK的表達(dá),并降低c-Myc的水平,促使細(xì)胞增殖受抑。(5)ATP1A13作用于Hep