DNA甲基化異常與多囊卵巢綜合征的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:多囊卵巢綜合征候選基因甲基化水平的研究
　　背景:
　　早在1935年，美國(guó)婦科醫(yī)生Stein與Leventhal便描述了閉經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)，不孕，多毛，肥胖和卵巢多囊性增大這一系列癥狀，并稱為Stein-Leventhal綜合征，也就是我們現(xiàn)在慣稱的多囊卵巢綜合征。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，我們對(duì)于這一古老疾病的認(rèn)識(shí)不斷更新，不斷深入，現(xiàn)在我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到多囊卵巢綜合征不僅僅是單純的涉及育齡婦女的生殖內(nèi)分泌疾病，多囊卵巢

2、綜合征還可對(duì)女性糖脂代謝、心血管、皮膚、骨骼、以及心理產(chǎn)生重大而深遠(yuǎn)的影響。多囊卵巢綜合征是多病因發(fā)病，從青春期遷延至絕經(jīng)期的，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性的，涉及多個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜性疾病，是令人談之色變的貫穿女性一生的夢(mèng)魘。
　　最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)婦女中，多囊卵巢綜合征的患病率高達(dá)5.6％(4)。攻克多囊卵巢綜合征難題具有深遠(yuǎn)的意義，然而，要想徹底攻克多囊卵巢綜合征診斷治療方面的諸多難題，從根本上解密多囊卵巢綜合征的發(fā)病機(jī)制刻不容緩。

3、現(xiàn)今，多囊卵巢綜合征的病因主要分為遺傳和非遺傳兩個(gè)方面。在遺傳方面，我們研究組通過前期全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法確定了多個(gè)多囊卵巢綜合征易感基因，然而在非遺傳方面，研究尚少有涉及，特別是多囊卵巢綜合征的表觀遺傳學(xué)研究正越來越多的引起人們的重視。在哺乳動(dòng)物中，表觀遺傳學(xué)信息可以表現(xiàn)為多種形式，DNA的甲基化是最早被人們所認(rèn)識(shí)也是研究最多的方向。正常細(xì)胞功能的行使有賴于表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的維持，而已有大量研究表明表觀遺傳的穩(wěn)態(tài)的打亂是與多種疾病的發(fā)

4、病相關(guān)的，其中就包括多種復(fù)雜疾病以及癌癥。甲基化是表觀遺傳學(xué)中為人們認(rèn)識(shí)最早也是了解的最清楚地現(xiàn)象。本部分研究便是從這些候選基因出發(fā)，研究這些多囊卵巢綜合征易感基因的甲基化水平在病患之中是否有變化。
　　目的:
　　我們通過篩選前期全基因組關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果，選取了THADA(thyroid adenoma associated),LHCGR(Luteinizing hormone/choriogonadotropin rece

5、ptor)以及TOX3(Thymocyte selection-associated high mobility group box)3個(gè)多囊卵巢綜合征候選基因。通過采集多囊卵巢綜合征患者以及正常受試者的外周血DNA，以重亞硫酸測(cè)序的方法檢測(cè)上述基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，以圖找到多囊卵巢綜合征中甲基化異常的候選基因。
　　方法:
　　我們收集了30例多囊卵巢綜合征患者以及30例年齡匹配的正常受試者的外周血標(biāo)本，提取基因組D

6、NA后，重亞硫酸測(cè)序的方法檢測(cè)上述基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　在多囊卵巢綜合征標(biāo)本的LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域的各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平普遍呈較低的水平，雖然整體甲基化水平的差異并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平，單個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平的分析顯示，-141位點(diǎn)和+17位點(diǎn)的低甲基化的顯著程度達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)水平(CpG-141:10.89％Vs.18.31％,P=0.023;CpG+17:2.02％Vs.8.4

7、5％,P=0.002)，經(jīng)過FDR法的校正后+17位點(diǎn)的低甲基化程度仍達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)水平。其他兩個(gè)基因，TOX3和THADA，它們的啟動(dòng)子區(qū)域呈普遍的去甲基化狀態(tài)，多囊卵巢綜合征病人與非多囊卵巢綜合征病人之間并無區(qū)別。
　　結(jié)論:
　　通過篩選多囊卵巢綜合征候選基因的甲基化水平，我們發(fā)現(xiàn)了多囊卵巢綜合征患者中LHCGR這一在生殖調(diào)節(jié)上有重要作用的基因的甲基化水平的異常，為多囊卵巢綜合征表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制提供了證據(jù)，為進(jìn)一步確證

8、LHCGR甲基化水平的異常以及探求其中機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與多囊卵巢綜合征的關(guān)系
　　背景:
　　在第一部分的研究中，我們篩查了多個(gè)多囊卵巢綜合征候選基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，其中，我們發(fā)現(xiàn)了在多囊卵巢綜合征患者外周血DNA中的LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度偏低的現(xiàn)象。LHCGR是黃體生成素以及絨毛膜促性腺激素的受體，是一種主要在卵巢以及睪丸表達(dá)的跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，

9、LHCGR的活化在人類生殖過程中的激素功能有著至關(guān)重要的作用。在人類卵巢中，LHCGR在顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、黃體細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在卵泡發(fā)育和甾體激素的合成等重要生物學(xué)事件有著舉足輕重的地位。更巧合的是，在由DHEAs誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型的卵巢組織中，人們亦發(fā)現(xiàn)了LHCGR去甲基化的現(xiàn)象。既往文獻(xiàn)顯示，LHCGR的轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)主要受到其啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化水平的影響。因?yàn)橥晃稽c(diǎn)的甲基化的水平在不同組織和細(xì)胞類型中是不

10、同的，為了驗(yàn)證這個(gè)假說，僅僅得到外周血中的數(shù)據(jù)是不足夠的，因此，我們又以體外受精一胚胎移植(IVF-ET)過程中得到的顆粒細(xì)胞為對(duì)象，檢測(cè)了其中LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度。顆粒細(xì)胞中異常的LHCGR甲基化水平或許通過影響LHCGR的轉(zhuǎn)錄在多囊卵巢綜合征的發(fā)病中起作用。另一方面，業(yè)已證明婦女中LHCGR的基因突變可能導(dǎo)致高雄激素血癥的表型，因此LHCGR的編碼序列和非翻譯序列有待于進(jìn)一步測(cè)序以排除可能的突變的存在。
　　目的

11、:
　　由于在第一部分中，我們發(fā)現(xiàn)了多囊卵巢綜合征患者外周血白細(xì)胞中LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度降低的現(xiàn)象，為了驗(yàn)證不同的細(xì)胞類型中是否有類似的情況，我們采用IVF-ET過程中的不孕患者的顆粒細(xì)胞，檢測(cè)了顆粒細(xì)胞中的LHCGR的甲基化情況，以驗(yàn)證LHCGR低甲基化是否存在于多種細(xì)胞中，并且檢驗(yàn)異常的LHCGR甲基化水平是否影響LHCGR的轉(zhuǎn)錄，從而確定LHCGR甲基化在多囊卵巢綜合征的發(fā)病中起作用。另一方面，多囊卵巢綜合征婦

12、女的LHCGR基因的編碼序列、啟動(dòng)予以及非翻譯區(qū)將被測(cè)序，以排除可能的遺傳變異的存在。
　　方法:
　　我們通過密度梯度離心的方法收集IVF-ET過程中不孕患者卵泡液中的顆粒細(xì)胞，其中有12份樣本來自多囊卵巢綜合征患者，12份樣本來自年齡匹配的正常受試者，提取DNA后，以重亞硫酸鹽測(cè)序的方法，檢測(cè)了顆粒細(xì)胞中LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度，并使用real time qPCR的方法檢測(cè)了LHCGR的轉(zhuǎn)錄水平，且用west

13、ern blotting的方法檢測(cè)了LHCGR的表達(dá)水平。另一方面，我們首先以DNA測(cè)序的方法檢測(cè)192名多囊卵巢綜合征病人的LHCGR的編碼序列、啟動(dòng)子以及非翻譯區(qū)。
　　結(jié)果:
　　在接受輔助生殖技術(shù)治療患者的顆粒細(xì)胞中的LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的檢測(cè)中，重亞硫酸鹽測(cè)序的結(jié)果顯示多囊卵巢綜合征患者的LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域呈總體低甲基化狀態(tài)(P=0.004)，其中CpG-174，-148，-61，-43，-8，

14、+10，+17以及+20在多囊卵巢綜合征患者中的甲基化程度明顯降低(CpG-174:14.00％vs.19.41％,correctedP=0.048;CpG-148:9.60vs.15.19％,correctedP=0.048;CpG-61:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-43:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-8:9.60％vs.14.77％,corrected

15、P=0.046;CpG+10:6.00％vs.10.13％correctedP=0.047;CpG+17:4.80％vs.10.13％correctedP=0.050;CpG+20:4.80％vs.10.13％,correctedP=0.050)。RealtimePCR以及westernblotting的結(jié)果顯示多囊卵巢綜合征患者顆粒細(xì)胞的LHCGR轉(zhuǎn)錄和翻譯水平升高。另一方面，通過對(duì)192例多囊卵巢綜合征病人的DNA測(cè)序并未發(fā)現(xiàn)新發(fā)突

16、變，僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)已知SNP(rs2293275,rs11125179和rs10176989)。
　　結(jié)論:
　　LHCGR基因作為多囊卵巢綜合征的重要易感基因，其DNA序列在多囊卵巢綜合征患者中并未發(fā)現(xiàn)變異。而通過多種方法多種細(xì)胞類型的檢測(cè)，其基因啟動(dòng)子區(qū)域呈明顯的低甲基化狀態(tài)，并使得LHCGR轉(zhuǎn)錄升高，可能參與PCOS的發(fā)病過程。
　　第三部分:導(dǎo)致多囊卵巢綜合征LHCGR基因甲基化水平紊亂因素的研究
　　背景:

17、
　　通過前面兩部分的研究，驗(yàn)證了多囊卵巢綜合征LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平紊亂在外周血以及顆粒細(xì)胞中的存在，且在顆粒細(xì)胞中，此種甲基化紊亂還是與LHCGR的表達(dá)變化的趨勢(shì)相同。在這個(gè)部分中，我們將從多個(gè)方面探尋可能影響多囊卵巢綜合征患者中LHCGR甲基化紊亂的可能因素。在常染色體非印記基因中也廣泛存在等位基因特異性的甲基化現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為SNP的基因型與鄰近的CpG位點(diǎn)甲基化水平之間的關(guān)聯(lián)。在本項(xiàng)研究中，我們研究LHCGR

18、基因的原因是因?yàn)槲挥谄鋬?nèi)含子的rs13405728這一SNP在我們前期的GWAS研究中達(dá)到了基因組顯著水平，在前面的研究中，受制于樣本量和實(shí)驗(yàn)方法的限制，我們不能得出SNP與甲基化水平之間的關(guān)系，因此我們?cè)诒静糠值难芯恐?，繼續(xù)擴(kuò)大了樣本量，將rs13405728以及rs4073366兩個(gè)SNP的基因分型信息與啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平。另外一個(gè)方面，激素水平可能導(dǎo)致甲基化程度的變化。高雄激素血癥是多囊卵巢綜合征最基礎(chǔ)的特征之一，高LH血癥也是

19、多囊卵巢綜合征的一個(gè)特點(diǎn)，并被列為日本制訂的多囊卵巢綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，這兩大激素引起了我們的興趣，在這一部分研究中，我們將體外培養(yǎng)21天小鼠的顆粒細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的睪酮和LH，以觀察是否對(duì)LHCGR基因的甲基化以及表達(dá)水平有影響，以探討多囊卵巢綜合征患者激素水平的異常與LHCGR甲基化水平之間的關(guān)系。
　　目的:
　　本部分主要探討兩個(gè)可能導(dǎo)致甲基化水平異常的因素，首先我們將檢驗(yàn)全基因組關(guān)聯(lián)分析所得的易感位點(diǎn)r

20、s13405728基因型與LHCGR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的關(guān)系，再以這部分?jǐn)?shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)所有標(biāo)本的LHCGR的5'非翻譯區(qū)的rs4073366進(jìn)行基因分型，再檢驗(yàn)rs4073366分型結(jié)果與甲基化水平的關(guān)系。另一方面，我們還將檢測(cè)兩種多囊卵巢綜合征特征性的激素水平異常對(duì)于LHCGR甲基化水平的影響。
　　方法:
　　我們首先利用前期全基因組關(guān)聯(lián)分析的數(shù)據(jù)和標(biāo)本，按照rs13405728的基因型挑選90份多囊卵巢綜合征標(biāo)本以及

21、90份正常對(duì)照標(biāo)本，使用焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)了這些多囊卵巢綜合征和健康對(duì)照標(biāo)本的LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，以分析rs13405728與甲基化水平之間的關(guān)系;用直接測(cè)序的方法對(duì)rs4073366進(jìn)行基因分型，分析rs4073366是否影響甲基化水平。另一方面，我們還利用小鼠的顆粒細(xì)胞體外加藥培養(yǎng)的方法，針對(duì)性的研究了睪酮以及LH對(duì)于LHCGR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平。
　　結(jié)果:
　　在多囊卵巢綜合征以及對(duì)照者標(biāo)本中

22、，基因型對(duì)于LHCGR啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平影響的趨勢(shì)是相同的，AA基因型導(dǎo)致各個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度較高，GG基因型則導(dǎo)致各個(gè)位點(diǎn)的甲基化程度較低，雜合的AG基因型的標(biāo)本的則處于兩種純和基因型之間，如果將多囊卵巢綜合征標(biāo)本數(shù)據(jù)和對(duì)照數(shù)據(jù)混合后，這種區(qū)別依然存在，且這種區(qū)別是達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)水平的(P＜0.05)。rs4073366則沒有明顯的對(duì)于LHCGR甲基化水平的影響。生理濃度的10-9M睪酮濃度的培養(yǎng)液組的LHCGR啟動(dòng)子區(qū)域則呈現(xiàn)較高的

23、甲基化狀態(tài)，高濃度的睪酮可導(dǎo)致去甲基化的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　rs13405728可以等位基因特異性的影響LHCGR的甲基化水平，而較高的睪酮水平將會(huì)導(dǎo)致LHCGR去甲基化的發(fā)生，我們?cè)诙嗄衣殉簿C合征病人中發(fā)現(xiàn)的LHCGR甲基化水平的變化可能是這兩個(gè)因素所導(dǎo)致的。
　　第四部分:多囊卵巢綜合征外周血全基因組DNA甲基化水平研究
　　背景:
　　多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最為常見的生殖內(nèi)分泌疾病

24、，其發(fā)病率高達(dá)6-8％。然而多囊卵巢綜合征的病理生理過程仍不為我們所知，在過去的十多年中，多囊卵巢綜合征發(fā)病的遺傳因素被廣泛的研究。我們最近的基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)多囊卵巢綜合征的易感基因，然而這些易感基因的發(fā)現(xiàn)不足以解釋多囊卵巢綜合征的異質(zhì)性與復(fù)雜性，現(xiàn)在的理論認(rèn)為，遺傳、表觀遺傳以及環(huán)境因素共同構(gòu)成多囊卵巢綜合征的發(fā)病因素。
　　正常細(xì)胞功能有賴于表觀遺傳組的穩(wěn)態(tài)，現(xiàn)在越來越多的研究表明表觀遺傳組的紊亂與多種人類疾病相關(guān)，特

25、別是癌癥與復(fù)雜疾病。對(duì)于多囊卵巢綜合征來說，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到這一領(lǐng)域的重要性，個(gè)別研究表明了多囊卵巢綜合征的某些基因(LMNA，follistatin，AR)甲基化水平的紊亂，我們前期的研究也表明LHCGR基因甲基化異常與多囊卵巢綜合征之間的關(guān)系。在既有的一項(xiàng)研究中，人們并未發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者與匹配的對(duì)照之間外周血中總體甲基化水平的區(qū)別。綜上，針對(duì)多囊卵巢綜合征進(jìn)行表觀基因組水平的DNA甲基化的關(guān)聯(lián)分析是十分有必要的。
　　目

26、的:
　　在本部分研究中，我們將使用Illumina公司的Infinium Human Methylation 450 Beadchip來進(jìn)行全基因組的DNA甲基化水平的分析，具體來說，將檢測(cè)超過470，000個(gè)CpG位點(diǎn)，覆蓋99％的RefSeq基因，通過實(shí)驗(yàn)，我們將評(píng)價(jià)外周血基因組甲基化水平與多囊卵巢綜合征之間的關(guān)系。
　　方法:
　　我們收集了300名多囊卵巢綜合征病人以及300名對(duì)照正常人的外周血，并提取DNA

27、。將每100份多囊卵巢綜合征或者正常對(duì)照標(biāo)本分別等量混合為一份。然后再將這些DNA混合液進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，后以Illumina Human Methylation 450 Bead Chip芯片進(jìn)行全基因組的DNA甲基化水平檢測(cè)。對(duì)于芯片結(jié)果，采用重亞硫酸鹽測(cè)序的方法對(duì)個(gè)別位點(diǎn)(IGF1R，UGR2b17，TNFα)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。根據(jù)芯片結(jié)果的Diffscore值確定差異位點(diǎn)?；蜃⑨屢约巴犯患鹊姆治霾捎肈atabase for

28、Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)實(shí)現(xiàn)。
　　結(jié)果:
　　Illumina Human Methylation 450 Bead Chip檢測(cè)了超過450，000個(gè)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了375個(gè)差異化的甲基化CpG位點(diǎn)，其中110個(gè)呈現(xiàn)低甲基化，而265個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)高甲基化水平，多數(shù)基因處于CpG島(island)，岸(shore)或者架(shelf)上，37