補氣活血方對慢性支氣管炎肺氣虛證大鼠細胞凋亡及相關(guān)基因蛋白bcl-2、fas表達的影響.pdf

1、目的：觀察補氣活血法對慢性支氣管炎（CB）肺氣虛證大鼠細胞凋亡及相關(guān)基因蛋白bcl-2、fas的影響，探討其治療作用機理，進一步揭示CB肺氣虛證形成的病理機制，為臨床防治該病提供實驗依據(jù)。
　　 方法：選用健康Sprague Dawley（SD）大鼠50只（雌雄各半），實驗前一周置于實驗環(huán)境中喂養(yǎng)。采用改良煙熏法復制CB肺氣虛證動物模型。將造模各組大鼠置于特制的1m×1m×1m的煙室中點燃熏煙，每日2次，每次30分鐘，持續(xù)40天

2、。正常對照大鼠則置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)。
　　 模型復制成功后，將CB肺氣虛證大鼠隨機分為分為模型對照組（模型組，model group）、補氣活血高劑量組（高劑組，high-dose group）、補氣活血低劑量組（低劑組，low-dose group）、補肺湯組（tonify lung recipe group），并設不加任何處理的正常對照組（normal group）。每組10只，雌雄各半。
　　 5組均于造模結(jié)束

3、后第2天起連續(xù)灌胃生理鹽水或藥物21天，每日1次。正常組與模型組灌服生理鹽水，均為10ml/kg；高劑組每日用藥劑量為25.6g/kg（相當于臨床成人用藥量的14倍），以0.18g/ml灌胃；低劑組每日用藥劑量為12.8g/kg（相當于臨床成人用藥量的7倍），以0.09g/ml灌胃；補肺湯組每日用藥劑量為8.63g/kg（相當于臨床成人用藥量的7倍），以0.09g/ml灌胃。
　　 于灌胃結(jié)束后第2天，各組大鼠分別麻醉后處死，開

4、胸取右側(cè)肺臟中部組織0.5cm×0.5cm×0.5cm大小組織塊，用4％多聚甲醛溶液（PH7.4磷酸鹽緩沖液配制）固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片，用于普通HE染色及TUNEL檢測、免疫組織化學染色。取數(shù)塊組織，用于流式細胞術(shù)檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、一般狀態(tài)觀察：造模組大鼠在煙熏12天后開始出現(xiàn)呼吸困難，咳嗽并兼有痰鳴音，蜷臥倦怠，飲食量及活動量減少，毛發(fā)光澤漸失，鼻腔可見分泌物，質(zhì)地清稀，消瘦便溏，腹部有硬塊，舌

5、色紫暗。正常組未見異常。與正常組相比較，造模組體重增長緩慢，與造模40天時體重增幅比較，造模組增加（94.48±14.16）g，正常組增加（104.69±23.65）g，兩組體重變化有明顯差異（P<0.05）。
　　 2、肺組織形態(tài)學觀察
　　 2.1肉眼觀察：正常組大鼠雙肺外觀無異常，肺葉輪廓清晰，表面光滑柔軟，粉紅色，彈性良好。模型組大鼠雙肺可見灰黑色斑點，肺表面略顯不平，表面無光澤，邊緣有點狀出血。
　　

6、2.2光鏡觀察：正常組可見細支氣管黏膜上皮完整，細胞排列整齊，細支氣管壁及肺泡無明顯病理形態(tài)學改變。模型組可見細支氣管管腔增大，管壁明顯增厚，部分上皮細胞壞死脫落，伴有大量慢性炎細胞浸潤，小靜脈有淤血現(xiàn)象。各治療組與模型組相比均有明顯改善。
　　 3、各組大鼠支氣管及肺組織細胞凋亡
　　 3.1 TUNEL和免疫組化檢測各組大鼠肺炎性細胞凋亡
　　 3.1.1 TUNEL檢測肺炎性細胞凋亡
　　 模型組大

7、鼠支氣管及肺組織炎細胞凋亡百分數(shù)明顯低于正常組，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療組與模型組炎細胞凋亡數(shù)比較明顯增加，組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組與低劑組相比，凋亡數(shù)目明顯增加（P<0.01）；高劑組與補肺湯組相比明顯增加，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑組與補肺湯組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 3.1.2免疫組化法檢測凋亡基因蛋白bcl-2
　　 模型組平均灰度值明顯低于正常組，有統(tǒng)計

8、學意義（P<0.01）。與模型組相比，各治療組的平均灰度值明顯升高，組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組與低劑組相比平均灰度值升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；高劑組與補肺湯組比較平均灰度值升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑組與補肺湯組相比較，平均灰度值升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 3.1.3免疫組化法測凋亡基因蛋白fas
　　 模型組平均灰度值明顯高于正常組，有統(tǒng)計學意義（P<0.01

9、）。與模型組相比，各治療組的平均灰度值明顯降低，組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組與低劑組相比平均灰度值降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；高劑組與補肺湯組比較，平均灰度值降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑組與補肺湯組相比較，平均灰度值降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 3.2流式細胞術(shù)檢測各組大鼠肺實質(zhì)細胞凋亡
　　 3.2.1流式細胞術(shù)檢測各組大鼠肺實質(zhì)細胞凋亡率
　　 模型組顯著

10、高于正常組，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各治療組大鼠細胞凋亡率與模型組相比明顯降低，組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組與低劑組相比較，高劑組細胞凋亡率有降低趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高劑組與補肺湯組相比凋亡率明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑組與補肺湯組相比凋亡率降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 3.2.2流式細胞術(shù)檢測各組大鼠肺實質(zhì)細胞周期
　　 G0/G1期

11、（細胞靜止期/合成前期）：模型組細胞百分數(shù)較正常組明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各治療組與模型組相比，細胞百分數(shù)均明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組與低劑組相比，高劑組有降低趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高劑組與補肺湯組相比明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低劑組與補肺湯組相比有降低趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 S期（細胞合成期）：模型組細胞百分數(shù)較

12、正常組明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各治療組與模型組相比，均明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑組細胞百分數(shù)與低劑組相比有升高趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高劑組與補肺湯組相比較明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低劑組與補肺湯組比較有升高趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 G2/M期（細胞合成后期/有絲分裂期）：模型組細胞百分數(shù)較正常組明顯降低，有統(tǒng)計學意義（

13、P<0.05）。高劑組與模型組相比較，細胞百分數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑組與模型組比較，有升高趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；補肺湯組與模型組比較，細胞百分數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各治療組之間比較未見統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 PI：模型組較正常組明顯降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各治療組與模型組相比，均明顯升高，組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中高劑

14、組與低劑組相比有升高趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高劑組與補肺湯組相比較明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低劑組與補肺湯組相比有升高趨勢，但統(tǒng)計學處理無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、CB肺氣虛狀態(tài)下，支氣管及肺組織炎性細胞存在凋亡延遲，凋亡相關(guān)基因蛋白bcl-2表達上調(diào)和fas表達下調(diào)。支氣管及肺組織實質(zhì)細胞存在凋亡過度導致支氣管及肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，成為CB肺氣虛證發(fā)生發(fā)

15、展的機制之一。
　　 2、補氣活血方能夠通過抑制炎性細胞凋亡相關(guān)基因蛋白bcl-2的表達并上調(diào)fas蛋白在肺炎癥細胞的表達，增加CB肺氣虛證支氣管及肺組織內(nèi)炎細胞的凋亡數(shù)目，促進炎癥細胞以凋亡的形式清除，對于限制炎癥及消散炎癥起到作用。
　　 3、補氣活血方能夠通過抑制肺實質(zhì)細胞的凋亡并促進肺細胞的增殖來提高肺實質(zhì)細胞的合成速度，恢復肺實質(zhì)細胞的數(shù)量和功能，加強肺組織的自我修復能力，為中醫(yī)藥治療CB肺氣虛證的作用機制賦予