立枯絲核菌AG1-IA誘導(dǎo)玉米差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、玉米紋枯病是由立枯絲核菌RhizoctoniasolaniKühn引起的真菌性病害。盡管該病主要發(fā)生在中國(guó)和東南亞地區(qū)，表現(xiàn)出一定的區(qū)域性，但是該病在近年內(nèi)表現(xiàn)出逐年加重和快速蔓延的趨勢(shì)，極有可能在未來幾年傳播到其他國(guó)家和地區(qū)，并成為一種世界性病害，在我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)，該病已成為制約玉米產(chǎn)量高低的主要病害，深入研究玉米對(duì)紋枯病的抗病機(jī)制，是尋找培育廣譜、高效、穩(wěn)定、持久抗病性品種的有效途徑。本研究利用電鏡檢測(cè)技術(shù)、抑制消減雜交(SSH)c

2、DNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)、反向Northern篩選技術(shù)、RT-PCR以及生物信息學(xué)分析方法相結(jié)合，通過建立相關(guān)抗病基因表達(dá)譜，從全基因表達(dá)的水平上探索玉米對(duì)紋枯病的系統(tǒng)抗病機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)所用材料為本課題組多年篩選鑒定出的高耐玉米紋枯病材料R15，紋桔病菌為立枯絲核菌高致病性融合菌群AG1-IA。玉米種子經(jīng)表面消毒，發(fā)芽，溫室培育幼苗至五葉期后移入大田，拔節(jié)期時(shí)采用人工嵌入法將兩粒布滿菌絲的麥粒接種到植株下位第三葉鞘，接種后接種部位用塑料

3、袋包裹以保溫、保濕，接種6小時(shí)后取下塑料袋，分別取接種后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h的玉米第三下位的葉片和葉鞘，電鏡觀察菌絲在接種葉鞘組織中的形態(tài)變化，提取葉片的總RNA構(gòu)建SSH差減文庫(kù)。獲得的主要結(jié)果如下： 1.采用電鏡檢測(cè)病菌的侵染過程后發(fā)現(xiàn)，接種12h后，菌絲在葉鞘細(xì)胞表面伸長(zhǎng)并生成少量分支；接菌后24h，菌絲交錯(cuò)生長(zhǎng)，呈現(xiàn)多分支的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；接菌后36h菌絲繼續(xù)分支、交錯(cuò)、纏結(jié)，形成侵染

4、墊雛形；接種后48h形成成熟侵染墊；接種后60h，侵染墊繼續(xù)增大，形成團(tuán)狀或帶狀菌絲團(tuán)；接種后72h、84h、96h，伴隨新一輪的菌絲生長(zhǎng)、分支、侵染墊形成等在葉鞘組織上擴(kuò)展，從而完成對(duì)寄主的擴(kuò)大侵染。另外，在接種24h后的各時(shí)間段均觀測(cè)到菌絲通過侵染釘直接進(jìn)入寄主或菌絲通過氣孔侵入寄主，病原菌大面積侵入寄主是在接菌后36～48h。而在接種72h以后，在葉鞘組織的橫斷面內(nèi)發(fā)現(xiàn)侵入的菌絲，說明菌絲侵入寄主后能在受侵細(xì)胞間擴(kuò)展。 2

5、.應(yīng)用數(shù)碼相機(jī)記錄病斑擴(kuò)展過程后發(fā)現(xiàn)，接種部位在接種后12h未出現(xiàn)病斑；在接種后24h有水浸狀小病斑出現(xiàn)；接種后36h病斑喪失葉綠素而呈白色；接種48h后在形成的白斑周圍出現(xiàn)新的水浸狀病斑的大面積擴(kuò)展；接種后60h擴(kuò)大的病斑喪失葉綠素呈白色，并與之前白色病斑連在一起組成兩個(gè)明顯的病斑；接種后72h，水浸狀病斑再次出現(xiàn)并逐漸縱下擴(kuò)展，而之前形成的兩個(gè)病斑輪廓更加明顯；接種后84h形成3個(gè)白色病斑；接種后96h水浸狀病斑繼續(xù)擴(kuò)展，且與前面三

6、個(gè)病斑相連，形成典型的紋枯病發(fā)病癥狀。 3.通過SSH和文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，分別構(gòu)建了R15受紋枯病病菌誘導(dǎo)后的正向和反向文庫(kù)。其中正向文庫(kù)包含480個(gè)克隆，反向文庫(kù)包含288個(gè)克隆。文庫(kù)插入片段的長(zhǎng)度介于200～750bp之間，平均長(zhǎng)度在450bp左右。 4.通過反向Northern雜交篩選，從正向文庫(kù)中篩選到正反雜交信號(hào)差異顯著的陽(yáng)性克隆54個(gè)，從反向文庫(kù)中篩選到陽(yáng)性克隆30個(gè)。將篩選到的陽(yáng)性克隆送交測(cè)序公司測(cè)序，序列經(jīng)D

7、NAMAN軟件去除載體冗余和引物序列后進(jìn)行序列間同源性比對(duì)，共獲得51條唯一的EST序列，其中來源于正向文庫(kù)的EST序列30條，來源于反向文庫(kù)的EST序列21條。 5.將篩選獲得的51條EST序列提交到Genbank進(jìn)行Blast比對(duì)，共獲得已知基因功能的EST序列35條，已知mRNA序列12條，新發(fā)現(xiàn)EST序列4條。對(duì)已知基因功能進(jìn)行分類后發(fā)現(xiàn)：基因參與抗病或防御途徑(23％)、信號(hào)傳導(dǎo)(20％)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(17％)、次級(jí)代謝

8、(14％)、蛋白質(zhì)修飾加工(6％)、初級(jí)代謝(6％)、能量代謝(6％)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(6％)等代謝途徑，另外還有1個(gè)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)(3％)有關(guān)。 6.采用RT-PCR方法對(duì)幾個(gè)重要功能的基因進(jìn)行不同時(shí)間段的表達(dá)驗(yàn)證，分析與玉米紋枯病菌誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同功能的基因在不同時(shí)間段的誘導(dǎo)表達(dá)量各不相同。 7.利用生物信息學(xué)方法并結(jié)合比較基因組學(xué)手段，將本試驗(yàn)獲得的已知功能的35條EST序列，與水稻基因組進(jìn)行比

9、對(duì)，確定其在水稻染色體上的位置，并得到與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，利用比較圖譜分析該標(biāo)記在玉米染色體上的同源標(biāo)記，獲得了其中25條EST序列在玉米染色體上的SSR標(biāo)記。而令我們感興趣的是一條代表絲氨酸羧肽酶基因的EST序列經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組中與該EST序列臨近的SSR標(biāo)記為RM25574，而該標(biāo)記與玉米第一染色體上的SSR標(biāo)記umc1245同源，同時(shí)該標(biāo)記又與課題組利用R15作為抗性親本構(gòu)建的群體所定位的玉米紋枯病抗性QTLqBLS

10、B1-c緊密連鎖，另有四個(gè)差異基因與抗性QTL存在連鎖關(guān)系。 8.對(duì)本試驗(yàn)獲得的功能基因進(jìn)行系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，紋枯病感染玉米植株后，一些與產(chǎn)量相關(guān)的重要基因在體內(nèi)的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。利用這些基因的已知信息，推測(cè)玉米感染紋枯病后伴隨產(chǎn)量降低可能的分子機(jī)理，并預(yù)測(cè)了相關(guān)的代謝模型，希望為今后抗病育種和高產(chǎn)材料的育種提供理論依據(jù)。 9.對(duì)本試驗(yàn)獲得的功能基因進(jìn)行綜合分析后，闡述玉米感染紋枯病后植株可能產(chǎn)生的抗性機(jī)制，并模擬了幾種代

11、謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)通路在抗病過程中的調(diào)控模型，通過該機(jī)制模型的闡述為今后進(jìn)一步克隆抗病基因和轉(zhuǎn)抗紋枯病基因的研究奠定基礎(chǔ)。 結(jié)合本研究的結(jié)果，對(duì)紋枯病菌感染后菌絲的組織病理學(xué)電鏡觀察，探討了紋枯病菌絲侵染的途徑，并初步確定了紋枯病對(duì)玉米自交系R15的侵染時(shí)間，為進(jìn)一步研究紋枯病的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)通過本研究構(gòu)建的SSH文庫(kù)，篩選到與玉米紋枯病抗性相關(guān)的基因，并對(duì)紋枯病病菌誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)及玉米對(duì)紋枯病的抗性機(jī)制進(jìn)行探討，為分離克