立枯絲核菌第45家族糖苷水解酶PAMP活性區(qū)段及位點的研究.pdf

1、玉米在我國國民經(jīng)濟和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，在我國糧食和飼料作物及工業(yè)原料方面占有舉足輕重的地位。玉米紋枯病已成為生產(chǎn)中的主要病害，隨著高密度栽培和高氮的推廣應用，該病害快速蔓延，在全國各地不同玉米產(chǎn)區(qū)產(chǎn)生不同程度的減產(chǎn)，嚴重影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)量和質量。
　　植物細胞壁是抵抗外界病原物入侵的天然屏障。植物病原真菌和細菌都能產(chǎn)生細胞壁降解酶，成為在植物細胞內(nèi)和細胞之間蔓延的主要致病因子，如纖維素酶和果膠酶等。近年來，人們越來越

2、注意到在真菌與植物互作機制方面起作用的細胞壁降解酶。PAMP分子是病原微生物表面存在的一些保守分子，廣泛存在于微生物中。植物模式識別受體通過識別病原物模式分子來激活體內(nèi)信號途徑，誘導防衛(wèi)反應從而限制病原物的入侵。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)，R. solani AG-1-IA融合群中具有PAMP活性的酶中有β-1,4-內(nèi)切纖維素酶EG1，EG1是一個PAMP分子，并且有研究證明了PAMP活性與催化活性相互獨立。為了進一步確定其發(fā)揮作用的區(qū)段

3、及具體位點，我們通過一系列實驗來探究。
　　我們將EG1的野生型命名為WT，通過基因定點突變將EG1氨基酸序列第32位的天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，Ala），導致其催化活性的喪失并命名為D32A。為了確定EG1發(fā)揮PAMP活性的區(qū)段，我們對EG1的六個相對保守的區(qū)段進行了突變，結果發(fā)現(xiàn)野生型WT突變區(qū)段C6后仍然具有較高的催化活力，能夠引起玉米、煙草等植物的葉片壞死，但是不能誘導PA

4、L、POD等防衛(wèi)反應基因的過量表達；D32A突變區(qū)段C6后幾乎沒有催化活性，既不能引起玉米、煙草等植物的葉片壞死，也不能誘導PAL、POD等防衛(wèi)反應基因的過量表達。然后利用PVX表達系統(tǒng)進行實驗。首先利用PCR擴增法將信號肽序列插入基因5’末端，然后將片段插入pGR106空載體構建PVX表達載體，而后經(jīng)過凍融法轉化農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101感受態(tài)細胞。將攜帶重組質粒的農(nóng)桿菌接種煙草葉片，以

5、轉化空pGR106載體的農(nóng)桿菌作為對照（CK），結果發(fā)現(xiàn)WT-C6可以使煙草葉片產(chǎn)生病斑，而D32A-C6則不可以。對于WT-C6和D32A-C6的不同表現(xiàn)，我們認為是其對細胞壁纖維素的降解所產(chǎn)生的效果。這些結果證明，C6保守區(qū)（序列為GCNWRFDWF）是EG1發(fā)揮PAMP活性的關鍵區(qū)段。
　　接著，為了進一步探究EG1的具體活性位點，我們將C6區(qū)段內(nèi)的所有氨基酸進行定點突變，并獲得相應的突變工程菌和蛋白，將調(diào)整好濃度的純酶接種

6、玉米后發(fā)現(xiàn)，其中一個蛋白RA不能引起玉米葉片的壞死。然后，用調(diào)整好濃度的RA的純酶接種玉米和煙草葉片，同時測定RA接種對玉米和煙草葉片活性氧產(chǎn)生的影響，以及對防衛(wèi)反應基因表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，RA不能使玉米和煙草葉片壞死，也不能使活性氧大量產(chǎn)生，同時不能引起防衛(wèi)反應基因的過量表達。同時利用PVX表達載體對d32a-ra進行表達，發(fā)現(xiàn)攜帶pGR106/pd32a-ra的重組質粒不能引起煙草葉片的壞死。這些實驗結果初步確定了EG1的具體活性