2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本研究旨在從分子生物學(xué)和臨床的角度探討腦蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)發(fā)病機(jī)制,為臨床制定確實(shí)有效的治療方案,改善SAH病人的預(yù)后提供依據(jù)。 第一部分、蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣與內(nèi)皮-氧化氮合酶基因多態(tài)相關(guān)研究。 目的:探討內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的已知多態(tài)與蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的相關(guān)性。 方法: 1.實(shí)驗(yàn)分組:SAH無CVS組、ASAH有CVS組、TSAH有CVS組,其中ASAH有CVS組和TSAH有

2、CVS組為實(shí)驗(yàn)組(98+96=194例)、SAH無CVS組為對照組(195例)。以家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性研究,為實(shí)驗(yàn)組194例和對照組100例。 2.全部病人均作如下檢查:包括3D-DSA、CT和TCCD檢查。分別探測頸外動脈、頸內(nèi)動脈、大腦前動脈、大腦中動脈、大腦后動脈、基底動脈、椎動脈。分別記錄各腦動脈的收縮峰血流速度,平均血流速度,舒張末期血流速度。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測上述指標(biāo)1次。 3.抽血檢查病

3、人DNA,采用兩對引物:決定T-786C含223個堿基對片段的多態(tài)的引物: 上游引物是5’-GCATGCACTCTGGCCTGAAGTG-3', 下游引物是5’-CAGGAAGCTGCCTTCCAGTGC-3’; 決定外顯子7內(nèi)含267個堿基對G894T的置換的片段的引物: 上游引物是5'CTGGAGATGAAGGCAGGAGAC-3' 下游引物是5’-CTCCATCCCACCCAGTCAATC-

4、3'。 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是在50μl的總?cè)莘e內(nèi)含80 ng染色體DNA、50pmol的每種引物、200 μmol/L dNTP、1.25U的TAQ FLDNA聚合酶(PGC Scientific Co.,F(xiàn)rederick,MD,USA)和5μl的10 ×PCR buffer緩沖液含15 mmol/L MgCl2(PGC Scientific Co.)。開始的變性溫度為94℃反應(yīng)5分鐘、隨

5、后循環(huán)40次在94℃的條件下反應(yīng)1分鐘、55℃反應(yīng)1分鐘和77℃1分鐘。在72℃下延伸5分鐘使擴(kuò)增完成。擴(kuò)增后進(jìn)行印跡:8微升的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入50μL的變性溶液[500 mmol/L NaOH、2.0 mol/L NaCl、25 mmol/L乙二胺四醋酸(EDTA)、0.0001%溴酚藍(lán)]并在真空條件下將其轉(zhuǎn)移到一個點(diǎn)印器具上的尼龍膜。轉(zhuǎn)移后將膜浸入2 × NaCl/枸櫞酸鈉溶液80℃下20分鐘吸干。并通過決定T-786C多態(tài)采用兩

6、個17個堿基對的等位基因特異的寡核苷酸探針:序列為5’-CTGGCCGGCTGACCCTG-3’和5'CTGGCTGGCTGACCCTG-3’決定G894T多態(tài)采用兩個17個堿基對的等位基因特異的寡核苷酸探針,序列如下:5’-GATGAGCCCCCGAACT-3’和5'GATGATCCCCCGAACT-3’進(jìn)行雜交,檢測內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的多態(tài)即基因型和等位基因頻率。 4.進(jìn)行病例對照研究,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

7、分析:連續(xù)變量比較采用T檢驗(yàn)。在對照組和兩個病例組基因型和等位基因頻率比較采用標(biāo)準(zhǔn)卡方檢驗(yàn)。根據(jù)Rothman的方法或分層卡方檢驗(yàn)計(jì)算其優(yōu)勢比和其可信區(qū)間。 結(jié)論:內(nèi)皮一氧化氮合酶的DNA序列的差異與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生有相關(guān)性。 第二部分、吸煙對動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人腦循環(huán)影響的研究。 目的:探討內(nèi)皮一氧化氮合酶基因?qū)ξ鼰煹膭用}瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人的腦循環(huán)的影響。 方法:根據(jù)吸煙量(每

8、年吸煙的量)≥200支和0支分為吸煙組和不吸煙組,其中吸煙組198例,不吸煙組196例。 1.全部病人夜間禁食后收集血漿來測量總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯水平。 2.進(jìn)行TCCD檢測:分別探測頸內(nèi)動脈(ICA)、大腦中動脈(MCA)。分別記錄各腦動脈的收縮峰血流速度(Vs),平均血流速度(Vm),舒張末期血流速度(Vd)。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測上述指標(biāo)1次。以公式:Vm=Vs+(Vd×2)/3計(jì)算平

9、均流速。 3.從外周血中提取DNA,以 C0:TTT CTC CAG CCC CTC AGA TG; 2684C:GGC AGA GGC AGG GTC AGA CG 2684T:CAT CAA GCT CTT CCC TGT CT T0:AGG CCC AGC AAG GAT GTA GT為引物,采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增:在總?cè)莘e20ul:包括50ng基因組DNA、0.25μmol/L

10、 2684T和2684C啟動子、0.063 μmol/L T0和C0啟動子、62.5 μmol/L dNTPs、45 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、11 mmol/L硫酸銨、 6.7 μmol/L,β-巰基乙醇、 4.5 μmol/L EDTA、1.5mmol/L MgCl2、和0.4 U Taq聚合酶。起始溫度為96℃,在94℃下30秒、60℃下30秒、72℃下20秒循環(huán)35次完成擴(kuò)增。將內(nèi)皮一氧化氮合酶基因的T

11、-786C多態(tài)進(jìn)行基因分型。通過尿中F2-異前列烷排泄物來評估吸煙者的氧化應(yīng)激。 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)論:內(nèi)皮一氧化氮合酶基因可改變吸煙的動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人的腦循環(huán),使腦血流速度增高。 第三部分、結(jié)合珠蛋白遺傳多態(tài)性與動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)性探討。 目的:探討動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血中結(jié)合珠蛋白(Hp)表型和Hp基因頻率的分布及其與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。

12、 方法:分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,其中實(shí)驗(yàn)組病人197例,其中98例ASAH發(fā)生腦血管痙攣及99例未發(fā)生腦血管痙攣,即又分為未痙攣組和痙攣組,年齡28~79歲,平均年齡(39.9±14.8)歲,已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人;對照組195例正常人,年齡27~79歲,平均年齡(38±15.3)歲,無高血壓、糖尿病、心腦血管病。其中痙攣組根據(jù)腦血管痙攣的程度分三分級。同時采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)檢測197例SAH病人和1

13、95例正常對照者血中Hp表型的分布。 結(jié)論:血清有Hp2-1和Hp2-2的人群可能對腦血管痙攣有遺傳易感性。Hp2基因在未痙攣組和痙攣組病人中有聚集現(xiàn)象,與其遺傳易感性增高有某種內(nèi)在聯(lián)系,可能在CVS發(fā)病及發(fā)展中起一定作用。 第四部分、載脂蛋白E基因多態(tài)性與動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)性研究。 目的:探討載脂蛋白E(APOE)基因多態(tài)與動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(ASAH)及腦血管痙攣(CVS)間的相關(guān)程度。

14、 方法: 1.研究對象及分類評估:實(shí)驗(yàn)組SAH病人,共197例,98例發(fā)生腦血管痙攣(CVS)及99例未發(fā)生腦血管痙攣,年齡28~79歲,平均年齡(39.9±14.8)歲,已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人;正常對照組195例,年齡27~79歲,平均年齡(38±15.3)歲,無高血壓、糖尿病、心腦血管病。所有病人在入院時進(jìn)行頭顱CT掃描并根據(jù)Fisher分級、Hunt and Hess分級及世界神經(jīng)外科醫(yī)師聯(lián)盟(WFNS)

15、臨床分級評分進(jìn)行分類;術(shù)后6個月參照格拉斯哥預(yù)后評分(GOS)判斷預(yù)后。 2.標(biāo)本采集:所有入選病人禁食12 h后,抽清晨空腹血5 ml,其中2 ml血(EDTA抗凝)常規(guī)提取DNA進(jìn)行APOE基因多態(tài)性分析;3ml血測定血脂、血糖等生化指標(biāo)。 3.血脂和載脂蛋白測定:血標(biāo)本采集后,在同一臺全自動生化分析儀進(jìn)行總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、載脂蛋白A(ApoA

16、)與載脂蛋白B(ApoB)測定。 4.基因組DNA提?。禾崛⊥庵苎蚪MDNA作為PCR擴(kuò)增模板,引物上游序列為:5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’,引物下游序列為:5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3'。 5.PCR擴(kuò)增及Cfol內(nèi)切酶消化:PCR擴(kuò)增在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行,其中包括基因組DNA 200 ng,引物10pmol/L,4×dNTP各100μmo

17、l/L,氯化鎂2.5 mol/L,二甲基亞砜10% (V/V),TaqDNA聚合酶1U,并加入1滴礦物油覆蓋反應(yīng)物。然后進(jìn)行95℃35 s變性,60℃35 s退火,70℃60 s延伸,共計(jì)30個循環(huán),最后72℃延伸10min。限制性酶切反應(yīng)也在20μl體系中進(jìn)行,其中包括PCR反應(yīng)產(chǎn)物12μl,Cfol內(nèi)切酶8U (10 U/μl),輕輕混勻后置于37℃消化過夜,消化產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。 6.銀染:電泳后凝膠用蒸餾水沖

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