瘤胃微生物氨基酸代謝及甲硫氨酸降解菌的研究.pdf

1、甲硫氨酸和賴氨酸是反芻動(dòng)物玉米-豆粕型日糧的限制性氨基酸，改善其利用率對于提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能具有重要意義。但由于反芻動(dòng)物瘤胃微生物對進(jìn)入瘤胃的部分飼料蛋白質(zhì)、氨基酸的發(fā)酵降解，導(dǎo)致大量的蛋白質(zhì)和氨基酸在瘤胃截流。為了提高氨基酸到達(dá)小腸的量，前人研究出了很多物理、化學(xué)的有效方法，但這些方法都不是從微生物的代謝途徑入手，僅是治標(biāo)的辦法，且處理成本較高。因此我們期望通過對瘤胃微生物代謝規(guī)律的研究和甲硫氨酸利用菌的分離，來調(diào)控瘤胃中參與氨基酸

2、代謝的重要酶的活性和瘤胃微生物中甲硫氨酸利用菌的數(shù)量，從而達(dá)到降低甲硫氨酸在瘤胃中的降解率，以及增加動(dòng)物對限制性氨基酸的利用率。 1.采樣和體外培養(yǎng)時(shí)間對瘤胃液氨基酸含量變化規(guī)律的影響，本試驗(yàn)旨在研究不同采樣時(shí)間和不同培養(yǎng)時(shí)間對瘤胃微生物的氨基酸代謝的影響，試驗(yàn)一采用3只裝有永久性瘤胃瘺管的薩能母羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，不同采樣時(shí)間和不同體外培養(yǎng)時(shí)間二因素下分別于飼前和飼后的不同時(shí)間點(diǎn)采集瘤胃液，經(jīng)分別處理后分裝到18個(gè)血清瓶中，分成兩組

3、，體外培養(yǎng)0、8、16h后抽取樣本，測定樣本中氨基酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明：不同采樣時(shí)間對于部分氨基酸的變化規(guī)律影響較顯著(P<0.05)；不同的體外培養(yǎng)時(shí)間對于谷氨酸(Glu)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lvs)以及氨基酸總量的變化規(guī)律都有相當(dāng)顯著的影響(P<0.05)。 2.混合瘤胃微生物體外利用甲硫氨酸、賴氨酸的研究，本試驗(yàn)旨在研究瘤胃液中的瘤胃微生物對添加的甲硫氨酸、賴氨酸利用情況，并進(jìn)一步探討添加氨基

4、酸對瘤胃液中尿素氮、部分酶活的影響。試驗(yàn)二將采集到的來自3頭裝有永久性瘺管的成年薩能山羊的瘤胃液混合后，平均分裝成18個(gè)瓶，隨機(jī)分成3個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)。采用6重復(fù)隨機(jī)因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)。第一組中每瓶添加甲硫氨酸2mM(0.25mol/L Met溶液8ml)，第二組中每瓶添加賴氨酸2mM (0.25mol/L Lys溶液8ml)，第三組中每瓶添加等體積蒸餾水作為空白對照組，體外培養(yǎng)16小時(shí)。試驗(yàn)結(jié)果表明：添加氨基酸后混合瘤胃液中的尿素氮(

5、UN)含量顯著高于對照組(P<0.05)：谷氨酸脫氫酶(GLDH)活性隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長而迅速增加，并且添加甲硫氨酸組的GLDH的活性明顯高于其他兩組(P<0.01)，而添加賴氨酸組的GLDH活性則極顯著低于甲硫氨酸組和對照組(P<0.01)；體外培養(yǎng)時(shí)間的長短對于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT或GOT)的活性基本沒影響，添加氨基酸后，賴氨酸有助于GGT活性的提高(P<0.05)，而甲硫氨酸對其基本不影響；添加的氨基酸和體外培養(yǎng)時(shí)間對于

6、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性沒有顯著的影響(P>0.05)；添加氨基酸組的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的活性顯著低于對照組(P<0.05)，但體外培養(yǎng)時(shí)間對于各組中GOT的活性沒有顯著的影響。 3.瘤胃甲硫氨酸利用菌的分離及鑒定，為了研究分析山羊瘤胃液中甲硫氨酸降解菌群的物種資源，以甲硫氨酸為唯一氮、碳源，對瘤胃微生物進(jìn)行嚴(yán)格的厭氧分離、純化，篩選出具有甲硫氨酸降解活性的三株細(xì)菌MB6-1、MB6-2、MB7-1，采用PCR方法擴(kuò)增出16S

7、 rDNA基因，測定其基因的核苷酸全序列，并做部分的生理生化鑒定。菌株MB6-1、MB6-2以及MB7-1的16S rDNA序列已經(jīng)被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，其序列號(hào)分別為DQ436917、EF581856、DQ453797：基于16S rDNA序列的同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MB6-1與普羅威登斯菌屬的同源性高達(dá)96.7％，所以它可能是普羅威登斯菌屬(Providencia)中的一個(gè)新種；而MB6-2與類芽孢桿菌屬Paenib

8、acillus cookii種的同源性達(dá)99.1％，故它可能是Paenibacillus cookii的一個(gè)亞種；菌株MB7-1與其他菌株的同源性都比較低，因此還不能斷定其種屬類別。 采樣時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間對于部分的氨基酸濃度和變化趨勢的影響都比較大，但Met和Lys的濃度始終呈現(xiàn)下降趨勢，瘤胃微生物更優(yōu)先利用賴氨酸，同時(shí)微生物降解這兩種氨基酸的速度要大于合成他們的速度；添加氨基酸和體外培養(yǎng)時(shí)間的延長對瘤胃液中UN的含量和GGT、G

9、LDH的活性影響較大(P<0.05)，但對GPT、GOT無顯著影響(P>0.05)，說明瘤胃微生物發(fā)酵過程中氧化酶的活性變化范圍比較大，從而氧化脫氨基反應(yīng)發(fā)生的幾率波動(dòng)性較大，而轉(zhuǎn)氨酶的活性相對比較穩(wěn)定，所以發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)相對比較穩(wěn)定。以甲硫氨酸為唯一氮、碳源，經(jīng)過嚴(yán)格篩選得到的菌株MB6-1、MB6-2和MB7-1，有利于我們今后研究分析山羊瘤胃液中甲硫氨酸降解菌群的更多物種資源，并期望通過對瘤胃中甲硫氨酸降解菌群數(shù)量的調(diào)控，來增加甲