生物人工腎小管輔助裝置構(gòu)建方法的初步研究.pdf

1、研究背景：急慢性腎臟功能衰竭是臨床常見(jiàn)的腎臟疾病，二十年來(lái)其主要治療方法之一就是以血液透析或血液濾過(guò)方式為主的腎臟替代療法。雖然它明顯延緩了腎衰患者的疾病進(jìn)展，但長(zhǎng)期血液透析帶來(lái)的一系列的并發(fā)癥以及二十年來(lái)居高不下的死亡率仍然無(wú)法得到根本解決。研究者認(rèn)為，目前的腎臟替代療法僅僅替代了腎小球?yàn)V過(guò)水溶性中小分子物質(zhì)的功能，而無(wú)法提供腎小管的重吸收、代謝、及內(nèi)分泌等重要生理功能。眾所周知，腎小管細(xì)胞在糖原再生、谷胱甘肽合成、以及其他中分子物質(zhì)

2、重吸收、活化VitD3等方面有著重要作用，從而有助于機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下的防衛(wèi)。但腎臟及其腎小管細(xì)胞潛在的免疫學(xué)功能，還較少為人認(rèn)識(shí)。同時(shí)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，喪失腎功能不再僅僅是疾病嚴(yán)重性的標(biāo)志，而已成為患者死亡率的獨(dú)立性預(yù)測(cè)因素。ARF患者向SIRS和膿毒癥發(fā)展的傾向性也提示腎功能，尤其是發(fā)生ATN后的腎小管細(xì)胞的功能在個(gè)體應(yīng)激狀態(tài)下起著關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)在敗血癥休克早期就出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的損害。因此，人們猜測(cè)如果及早地替代

3、在膿毒癥休克中受損的腎小管上皮細(xì)胞的生理活性，或許可以改善SIRS階段機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，從而減輕進(jìn)一步破壞性發(fā)展的過(guò)程。而目前倍受關(guān)注的細(xì)胞療法的特點(diǎn)就是利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增某種特定細(xì)胞，通過(guò)體外循環(huán)或者植入體內(nèi)的方式，來(lái)替代、修復(fù)或增強(qiáng)各種疾病狀態(tài)下受損的組織器官的重要生理功能。生物人工腎小管就是基于細(xì)胞療法在腎臟病領(lǐng)域應(yīng)用提出的概念。將一定數(shù)量的腎小管上皮細(xì)胞種植在某種稱(chēng)為生物人工腎小管輔助裝置(Bioartificialr

4、enaltubuleassistdeviceRAD)中，利用裝置內(nèi)的腎小管上皮細(xì)胞活性組成生物反應(yīng)器，從而人工實(shí)現(xiàn)腎小管的生理功能。HumesHD等已經(jīng)成功完成了生物人工腎小管輔助裝置(BioartificialrenaltubuleassistdeviceRAD)的構(gòu)建，在體外條件下對(duì)裝置進(jìn)行功能檢測(cè)，表明該裝置內(nèi)腎小管上皮細(xì)胞具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能、代謝功能(活化vitaminD，產(chǎn)生碳酸氫鹽和氨，代謝谷胱甘肽等)、內(nèi)分泌功能。將RAD串連普

5、通血液濾過(guò)器形成生物人工腎(BioartificialKidneyBAK)后，連接至急性腎衰犬模型形成體外血液循環(huán)，證實(shí)不但可以實(shí)現(xiàn)濾過(guò)、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及內(nèi)分泌等腎臟功能，還可以改善心血管功能不良，調(diào)節(jié)系統(tǒng)炎癥失衡，延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間。越來(lái)越多的人們認(rèn)識(shí)到：大多數(shù)的疾病進(jìn)程并不是由于缺少某單個(gè)蛋白而是通過(guò)各種細(xì)胞產(chǎn)物間復(fù)雜的相互作用的改變而引起的?；诩?xì)胞療法的生物人工腎小管具有極大的發(fā)展?jié)摿ΑＵ腔谝陨匣A(chǔ)理論及應(yīng)用研究的堅(jiān)實(shí)背景，本著將

6、生物人工腎應(yīng)用于臨床治療，實(shí)現(xiàn)造福各種急慢性腎衰患者的美好愿望，本次研究著重于生物人工腎小管輔助裝置的構(gòu)建工作，為以后進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至臨床實(shí)驗(yàn)提供工作平臺(tái)。 研究目的：初步研究生物人工腎小管的裝置組成，模擬種植細(xì)胞的生長(zhǎng)條件，從方法學(xué)上來(lái)探討生物人工腎小管的體外構(gòu)建過(guò)程。 研究方法：一.生物腎小管輔助裝置設(shè)計(jì)基本構(gòu)建步驟：用F60高通量血液濾過(guò)器和連接管道組成基本裝置待用。取50ml無(wú)血清RPMI1640預(yù)充濾器內(nèi)腔

7、。制備層粘連蛋白溶液2μg/m2(無(wú)血清RPMI1640)30ml，注入濾器內(nèi)腔。固定濾器方向，放置1小時(shí)后旋轉(zhuǎn)180°，再放置1小時(shí)。0.25％胰酶消化細(xì)胞，加入含1％胎牛血清RPMI1640，吹打制備單細(xì)胞懸液80mL，細(xì)胞計(jì)數(shù)約6.2×107。濾器外腔注入10％胎牛血清RPMI1640約150ml。濾器兩端內(nèi)腔入口各灌入細(xì)胞懸液約10ml，固定濾器方向，放置90分鐘。濾器順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，再次灌注細(xì)胞，直到濾器完成旋轉(zhuǎn)360°后，

8、放入孵箱24小時(shí)。以150μl/min的速度向?yàn)V過(guò)器外腔持續(xù)泵入培養(yǎng)液，持續(xù)4天。以10μl/min的速度向?yàn)V過(guò)器內(nèi)腔持續(xù)注入培養(yǎng)液，持續(xù)10天。 二.組織學(xué)處理分別在種植細(xì)胞第1、4、14天切開(kāi)濾過(guò)器，取出聚砜膜纖維，4％多聚甲醛或95％酒精浸泡固定。常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木紫—伊紅(HE)染色，光鏡下觀察纖維切片。 結(jié)果：在種植LLC-PK1細(xì)胞第1天取出的聚砜膜纖維切片中，發(fā)現(xiàn)了少量貼壁的細(xì)胞，而在種植細(xì)胞第4、14