孕期邊緣型維生素A缺乏對(duì)仔鼠肺發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：了解胚胎期開始的邊緣型維生素A缺乏（MVAD）對(duì)仔鼠生后不同時(shí)間點(diǎn)肺發(fā)育、肺泡結(jié)構(gòu)和肺泡上皮的影響，以及在生后早期給予維生素A干預(yù)（VAI）對(duì)肺損傷的恢復(fù)程度。 方法：清潔級(jí)健康雌性Wistar大鼠18只隨機(jī)分為3組，飼以相應(yīng)飼料，3周后與健康雄性Wistar大鼠交配，1：2雌雄合籠：（1）正常對(duì)照組（Control）（6只），給予VA充足飼料（含VA6500 IU/kg），隨機(jī)抽取39只仔鼠用于本實(shí)驗(yàn)，仔鼠飼料與母鼠相同

2、：（2）MVAD組母鼠（6只），給予MVAD飼料（含VA400 IU/kg），隨機(jī)抽取39只仔鼠用于本實(shí)驗(yàn)，仔鼠飼料與母鼠相同；（3）生后干預(yù)組（VAI）（6只），給予MVAD飼料至分娩，然后改飼VA充足飼料，隨機(jī)抽取39只初生仔鼠用于本實(shí)驗(yàn)，仔鼠于生后l天開始給予5倍RNI VA灌胃，每天一次連續(xù)7天，斷乳后換為正常飼料。各組仔鼠于出生時(shí)、生后2周、8周齡處死。記錄仔鼠體重和肺重，用高效液相色譜法（HPLC）檢測血清和肺組織VA濃度，

3、形態(tài)定量學(xué)方法分析肺泡隔厚度，肺泡數(shù)量和肺泡表面積的改變，同時(shí)用半定量RT-PCR方法檢測肺泡上皮特有的表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-B，SP-CmRNA水平的變化。 結(jié)果：①血清VA濃度：MVAD母鼠交配時(shí)血清VA濃度明顯低于對(duì)照組，孕鼠和仔鼠未出現(xiàn)明顯VA缺乏的臨床表現(xiàn)。仔鼠生后各時(shí)間點(diǎn)血清VA濃度均低于Control組（P<0.05），而肺組織VA濃度出生時(shí)和正常組無明顯區(qū)別，但2周和8周時(shí)低于正常組（P<0.05）。VAI組

4、生后2w血清VA濃度即恢復(fù)至正常，而肺組織VA濃度一直維持在穩(wěn)定水平，和正常組無明顯區(qū)別。②體重和肺重：MVAD組出生時(shí)、生后2周體重均明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），8周時(shí)3組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但正常組和VAI組均略高于MVAD組。MVAD組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)肺重均低于正常對(duì)照組（P<0.05），VAI組8周時(shí)肺重恢復(fù)至正常水平。肺重/體重分?jǐn)?shù)顯示各時(shí)間點(diǎn)三組間無差異，2周和8周時(shí)MVAD組和VAI組略高于正常對(duì)照組。③肺組織形態(tài)學(xué)

5、定量分析：MVAD組仔鼠在各時(shí)間點(diǎn)肺泡隔均顯著厚于正常對(duì)照組（P<0.05），2周和8周時(shí)肺泡表面積和肺泡數(shù)量均少于正常對(duì)照組（P<0.05）。VAI組8周時(shí)除肺泡表面積仍少于正常對(duì)照組其余無明顯區(qū)別。④肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白：正常對(duì)照組肺組織表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-B，SP-CmRNA水平生后1天、2周和8周無明顯區(qū)別，但MVAD和VAI組各時(shí)間點(diǎn)均高于Control組（P<0.05）。 結(jié)論：①從胚胎期開始的MVAD會(huì)影響

6、仔鼠肺發(fā)育過程，表現(xiàn)為肺重的減輕，肺泡隔增厚，肺泡數(shù)量和肺泡表面積的減少，可持續(xù)至成年期。②生后早期進(jìn)行VA干預(yù)可以恢復(fù)大部分肺發(fā)育和結(jié)構(gòu)的改變，但至成年期時(shí)肺泡表面積仍不能完全恢復(fù)至正常。③MVAD會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮特有的表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-B，SP-C mRNA水平上調(diào)，而VAI組這種改變也不能恢復(fù)至正常水平。 目的：探討胚胎期開始的邊緣型維生素A缺乏（MVAD）對(duì)仔鼠生后不同時(shí)間點(diǎn)肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)彈性纖維、膠原的結(jié)構(gòu)和

7、量的影響，以及在生后早期給予維生素A干預(yù)（VAI）的恢復(fù)程度。 方法：清潔級(jí)健康雌性Wistar大鼠18只隨機(jī)分為3組，飼以相應(yīng)飼料，同第一部分。各組仔鼠于出生時(shí)、生后2周、8周齡處死。用醛品紅染色法檢測肺組織彈力纖維的分布，結(jié)構(gòu)和量的改變，用Masson三色染色法觀察肺組織膠原纖維的分布，結(jié)構(gòu)和量的改變，用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸含量。 結(jié)果：①彈性纖維被染成紫紅色，沉積在肺泡間隔，細(xì)支氣管。生后1天MVAD組未發(fā)現(xiàn)

8、彈性纖維的減少，但在2周和8周時(shí)明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05），彈性纖維結(jié)構(gòu)粗糙不光滑。生后早期VA干預(yù)可以使彈力纖維恢復(fù)至正常組水平，結(jié)構(gòu)也變得規(guī)則有序。②膠原被染成藍(lán)灰色，沉積在肺泡間隔，細(xì)支氣管及血管壁，排列整齊。MVAD組肺泡間隔、細(xì)支氣管、小血管膠原纖維明顯增多，互相交織呈網(wǎng)狀，著色較深，外表粗糙。MVAD組膠原蛋白的沉積在生后1天低于正常對(duì)照組，但在生后2周（P<0.05）及8周（P<0.05）時(shí)高于正常對(duì)照組，但是呈現(xiàn)

9、的是無規(guī)律的形態(tài)。生后早期VA干預(yù)在2周及8周時(shí)能降低膠原的沉積，且形態(tài)規(guī)則。③隨著年齡增長各組仔鼠肺組織羥脯氨酸含量逐漸增加，MVAD組出生時(shí)羥脯氨酸略低于Control組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2周和8周時(shí)明顯增加（P<0.05）。VAI組出生時(shí)略低于Control組，生后2周、8周和Control組相比無明顯差異。 結(jié)論：①從胚胎期開始的MVAD會(huì)影響仔鼠肺基質(zhì)彈力纖維的結(jié)構(gòu)和量，主要表現(xiàn)為生后彈力纖維的減少和結(jié)構(gòu)的紊亂。②

10、從胚胎期開始的MVAD會(huì)影響仔鼠肺基質(zhì)膠原的分布和沉積，表現(xiàn)為生后2周和8周膠原纖維的過度沉積和結(jié)構(gòu)紊亂，而羥脯氨酸也顯示膠原蛋白的增多。③而生后早期給予VA干預(yù)可以使彈力纖維和膠原結(jié)構(gòu)和量恢復(fù)至正常水平。 目的：進(jìn)一步探討胚胎期開始的MVAD對(duì)仔鼠肺發(fā)育的影響是否通過調(diào)節(jié)其體內(nèi)活性代謝物質(zhì)RA的核受體RARs發(fā)揮作用。 方法：清潔級(jí)健康雌性Wistar大鼠18只隨機(jī)分為3組，飼以相應(yīng)飼料，同第一部分。各組仔鼠于出生時(shí)、

11、生后2周、8周齡處死。用半定量RT-PCR方法檢測肺組織RARα、β、γ的mRNA水平，用免疫熒光激光共聚焦方法觀察RARs在肺組織中的空間分布和表達(dá)量的改變，進(jìn)一步用western-blotting方法了解RARs蛋白水平的變化及亞細(xì)胞定位。 結(jié)果：①生后正常肺組織中RARa mRNA表達(dá)最強(qiáng)，而RARγ表達(dá)最弱。RARa和RARβ均在出生時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，隨著年齡的增長至成年期表達(dá)減弱，RARγ無明顯變化。MVAD對(duì)于RARa和R

12、ARβ的mRNA水平有明顯影響表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄水平的增強(qiáng)（P<0.05）。②免疫熒光激光共聚焦顯示熒光強(qiáng)度變化與mRNA表達(dá)基本相符。生后RARs的空間定位主要為肺泡間隔的一些散在的細(xì)胞中，在支氣管和血管僅有少量的表達(dá)。而MVAD對(duì)于空間定位無明顯影響。③western-blotting的結(jié)果顯示MVAD組RARa和RARβ蛋白水平在2周和8周是明顯增加。提示VA對(duì)于RARs的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均有明顯的影響。而RARs蛋白的表達(dá)存在胞核向胞

13、漿的轉(zhuǎn)移過程，表現(xiàn)為在8周肺泡發(fā)育結(jié)束時(shí)，RARa和RARβ也從胞核中轉(zhuǎn)移至胞漿。而RARs蛋白的亞細(xì)胞定位也受到VA營養(yǎng)狀態(tài)的影響，MVAD時(shí)胞核表達(dá)明顯增強(qiáng)，至8周時(shí)胞核內(nèi)仍有表達(dá)。但生后早期的干預(yù)RARs mRNA、蛋白水平和亞細(xì)胞定位不能恢復(fù)至正常。 結(jié)論：①肺表達(dá)RARs受體的種類和量具有一定的年齡階段性，而這種特異性伴隨肺泡發(fā)育的全過程。不同年齡階段RARs的亞細(xì)胞定位存在從胞核至胞漿的轉(zhuǎn)移過程，而這一過程與生后肺泡