慢性應激抑郁型小鼠黃褐斑實驗動物模型的研究.pdf

1、黃褐斑的病因復雜，主要致病因素有紫外線照射、內分泌失調、情緒變化等。長期紫外線照射可使黑色素細胞增殖，而黑素的生成是酪氨酸酶一系列氧化反應并使體內氧化與抗氧化過程出現異常，如過氧化脂質(LPO)升高、SOD下降等，所以可以通過皮膚黑色素病理形態(tài)學，LPO的衍生物MDA及SOD量的變化研究黃褐斑實驗動物模型。本課題采用慢性應激刺激法致小鼠出現抑郁癥狀，用雌激素(黃體酮)全身攻擊小鼠，并同時對其進行局部照射紫外線來建立黃褐斑實驗動物模型進行

2、探討，并與其他小鼠黃褐斑實驗動物模型進行對照研究。 目的： 通過給小鼠進行紫外線照射局部、注射黃體酮和慢性應激抑郁刺激法綜合作用，建立慢性應激抑郁型小鼠黃褐斑實驗動物模型，并與紫外線照射動物模型建立的方法對比觀察。 材料與方法： 一、材料 1、動物 健康雌性BALB/C小鼠，清潔級(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。 2、實驗藥品和試劑 黃體酮注射液20mg/ml，超氧化物

3、歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HMB45鼠單克隆抗體(英國abcam公司)。 3、實驗器材 德國DuaLight TM UVA/UVB高能紫外光治療儀(UV120-2)；CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)2000型(空軍總醫(yī)院與北京航空航天大學共同研制的)。 二、方法 (一)動物分組 取小鼠30只，隨機分為3組：正常組6只、紫外線組12只、慢性應激抑

4、郁組12只。造模時間，第一批小鼠實驗進行21天，第二批小鼠實驗進行28天。 (二)實驗分組 1、正常組：每周脫毛1～2次，每天肌肉注射注射用水5ml/kg體質量，連續(xù)21天觀察小鼠的脫毛部位皮膚變化情況。 2、紫外線組：先通過預實驗得到BALB/c小鼠皮膚長波紫外線(UVA330nm～380nm)最小光毒量(MPD)為10J/cm2，中波紫外線(UVB304nm～311nm)最小紅斑量( MED)為660mJ/c

5、m2。根據預實驗得出照射方法，第1天以0.7MPD+0.7MED每日照射一次，連續(xù)照射6天，第7天小鼠皮膚出現輕微結痂脫屑，停止照射2天；第9天、第12天以0.5MPD+0.5MED照射一次，第16天、第19天以0.25MPD+0.25MED照射一次；第一批照射21天。第二批在停止刺激后一周處死。 3、慢性應激抑郁組：按照經典抑郁模型加以改進處理方法：紫外線照射方法同紫外線組。每日肌肉注射0.4％黃體酮5ml/kg體質量，第一批

6、小鼠連續(xù)21天。第二批小鼠在停止全部刺激后一周處死。 (三)抑郁模型測定 1、曠場實驗 2、實驗開始結束時小鼠體質量(體重)變化 3、液體消耗試驗 (四)MDA及SOD活性測定 同時取肝臟及脫毛部位皮膚，用預冷生理鹽水(4℃)沖洗，除盡雜質，拭干，切取皮膚0.2g、肝臟0.5g，分別放入有9倍于組織塊的預冷生理鹽水的小試管內，將剪碎的組織倒入玻璃均漿管中，上下轉動研磨20～30次，充分研碎

7、，使組織均漿化。均漿后以3500r/min離心8分鐘，取上清液采用試劑盒檢測MDA、SOD活性。 (五)皮膚黑色素細胞的病理形態(tài)學觀察 第一批小鼠當脫毛部位皮膚出現明顯的色變(照射21天)，取去毛皮膚1塊(1cm×1cm)，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。再經脫蠟至水、抗原修復后，應用免疫組織化學法，用HMB45為第一抗體，免疫組化二步法，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗做陰性對照。第二批小鼠在實驗28天后

8、處死取皮，余病理步驟同上。 (六)黑色素陽性目標用計算機進行圖象分析 每張切片在顯微鏡物鏡40X下，隨機選擇5個視野進行彩色圖像采集與存儲，計算出每個視野的形態(tài)學陽性目標(靶目標)中的數密度、光密度參數的總和平均數，各組間參數的標準差(-x±S)、標準誤、變異系數。 (七)統(tǒng)計學分析 SPSS12.0統(tǒng)計學軟件，數據以(-x±S)表示，進行方差分析，t檢驗。 結果： 一、抑郁模型

9、 黃體酮+紫外線+慢性應激抑郁組小鼠的穿格次數、直立次數、理毛次數均較正常組有所減少，并有顯著差異。體重增加最少，糖水消耗顯著低于正常組(P<0.05)提示慢性應激刺激21天后的小鼠出現了抑郁的征象。 二、MDA及SOD的水平 在5組中，紫外線組、慢性應激抑郁組兩種模型小鼠肝臟與皮膚的MDA水平均較正常組升高，SOD活性較正常組有所下降。其中，慢性應激抑郁組21天組小鼠皮膚SOD經統(tǒng)計學處理有極顯著性差異(p<0.01)

10、，慢性應激抑郁組28天組小鼠皮膚、肝臟MDA有極顯著性差異(p<0.01)。提示這種模型建立法對于小鼠皮膚、肝臟MDA、SOD的活性影響非常大。 三、皮膚黑色素細胞的病理形態(tài)學結果 (一)小鼠表皮黑色素沉著數量 模型組小鼠皮膚黑素細胞的個數均較正常組有所增加，其中慢性應激抑郁21天組有顯著性差異。模型組數密度明顯高于正常組，尤其是慢性應激抑郁模型21天組可見與正常組有顯著差異。 (二)小鼠表皮黑色素沉著深

11、淺度 模型組小鼠皮膚黑色素陽性目標的平均光密度明顯高于正常組，統(tǒng)計學有顯著性差異。 結論： 本實驗結果顯示慢性應激抑郁型小鼠黃褐斑模型組黑色素著色面積、黑色素細胞數量明顯大于正常組，黑色素著色深度明顯增加，經統(tǒng)計學分析后有顯著性差異。小鼠皮膚和肝臟的MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低，符合黃褐斑的生物化學改變特征，具備黃褐斑的主要臨床特征。 本實驗優(yōu)點在于方便計算紫外線照射量，照射部位及取材部位固定，