PTEN抑制劑在新生鼠腸道損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、目的:制備新生鼠腸道損傷修復(fù)模型，給予PTEN抑制劑—phen干預(yù)腸道損傷修復(fù)過程。通過腸道組織病理切片，按照Nadler評分標(biāo)準(zhǔn)[1]評估腸道病理損傷情況，觀察腸道損傷修復(fù)過程中不同時間點腸道組織病理改變。通過Real time PCR、Western blot技術(shù)，觀察損傷修復(fù)過程中Lgr5、β-catenin和PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)及隨時間變化情況。初步探索PTEN抑制劑phen在新生鼠腸道損傷修復(fù)中的作用。
　　第

2、一部分 PTEN抑制劑作用于新生鼠腸道損傷修復(fù)模型的組織學(xué)變化研究
　　方法:利用缺氧和冷刺激復(fù)制新生大鼠腸道損傷修復(fù)模型。1日齡新生鼠（清潔級，SD大鼠）隨機(jī)分為正常對照組(N)、實驗對照組(C)及干預(yù)組(E)。均由母鼠喂養(yǎng)。正常對照組不給予任何刺激與干預(yù)。實驗對照組和干預(yù)組，每天早8點和晚8點同時給予缺氧（含6％O2的N2，30min）及冷刺激(4℃冰箱，20分鐘)各1次，連續(xù)3天。每天第1次缺氧冷刺激后，干預(yù)組另給予phen

3、1.6μmol/kg/d（生理鹽水溶解，濃度為0.08μmol/ml）腹腔注射，而實驗對照組則給予相同容量生理鹽水腹腔注射。制模過程中觀察新生鼠對刺激的反應(yīng)、進(jìn)食情況及活動狀況，觀察新生鼠有無腹脹、腹瀉及胃潴留，并于實驗前和實驗后第4天(完成制模后24h)測量體重，比較各組新生鼠體重變化情況。分別于實驗最后一次缺氧和冷刺激后24h(1d)、48h(2d)、72h(3d)和120h(5d)脫臼處死新生大鼠5只，標(biāo)記為N1、N2、N3、N5

4、;C1、C2、C3、C5和E1、E2、E3、E5（各組5只，共60只）。取新生鼠回盲部腸道組織做病理切片，用Nadler評分標(biāo)準(zhǔn)[1]評估腸道損傷與修復(fù)情況。
　　結(jié)果:
　　1.制模過程中，實驗對照組和干預(yù)組新生鼠相繼出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食減少、活動下降，并伴有不同程度的腹瀉、腹脹。
　　2.實驗前，正常對照組、實驗對照組和干預(yù)組新生鼠平均體重分別為7.36±0.10g、7.59±0.19g和7.60±0.11g，三組新

5、生鼠平均體重差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.407;實驗后，正常對照組、實驗對照組和干預(yù)組的平均體重分別為11.17±0.15、10.38±0.31和10.75±0.14g，實驗對照組體重明顯低于正常對照組，P=0.032，差異具有有統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)組平均體重雖低于正常對照組但高于實驗對照組，組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，PEvsN=0.054、PEvsC=0.295。
　　3.標(biāo)本取材中發(fā)現(xiàn)，實驗對照組和干預(yù)組新生鼠腹腔有不同程度的渾

6、濁，甚至血性滲液，腸管色澤異常，呈節(jié)段性水腫充血、斑片狀出血或彈性消失，解剖時偶可見到腹腔內(nèi)有糞便。
　　4.HE染色正常對照組的回盲部絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則;腺體排列規(guī)則、組織結(jié)構(gòu)清楚;固有層血管無擴(kuò)張，無明顯充血及炎性細(xì)胞浸潤。干預(yù)組和實驗對照組中可見不同程度的粘膜及粘膜下層充血水腫;固有層炎癥細(xì)胞浸潤;粘膜不同程度的點狀、片狀壞死脫落;病理評分介于1-3級之間。干預(yù)組、實驗對照組病理損傷程度明顯重于正常對照組，三樣本比較的秩

7、和檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.000，干預(yù)組較實驗對照組平均病理損傷程度較輕，但無統(tǒng)計學(xué)差異，p=0.468。
　　結(jié)論:
　　1.6％O2缺氧30min及4℃冷刺激20min制備的新生鼠腸道損傷修復(fù)模型，外觀表現(xiàn)、體重變化及腸道組織病理改變明顯，且模型存活時間較長，更有利于組織病理的實驗研究。
　　2.模型中病理損傷最重出現(xiàn)于實驗后第2、3天，第5天腸道病理損傷程度較第2、3天減輕，反映腸道損傷后自我修復(fù)過程。<

8、br>　　3.PTEN抑制劑干預(yù)新生鼠腸道損傷修復(fù)過程，可改善其外觀表現(xiàn)，體重較病變組增加，病理損傷程度減輕，但不具統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.468。
　　第二部分 PTEN抑制劑影響腸道損傷修復(fù)過程中Lgr5、β-catenin和PTEN基因表達(dá)的實驗研究
　　方法:同第一部分實驗方法，復(fù)制新生鼠腸道損傷修復(fù)模型同時給予PTEN抑制劑—phen干預(yù)，分為正常對照組(N)、實驗對照組(C)和干預(yù)組(E)。分別于最后一次缺氧冷刺激后

9、的24h(1d)、48h(2d)和72h(3d)取回盲部腸道標(biāo)本（標(biāo)記為N1、N2、N3; C1、C2、C3; E1、E2、E3，每組5只，共45只）。通過Real-time PCR和Western Blot分子生物學(xué)技術(shù)，測定腸道組織勻漿中Lgr5、β-catenin和PTEN基因的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，初步探索PTEN抑制劑在腸道損傷修復(fù)過程中的影響作用。
　　結(jié)果:
　　1.Lgr5 mRNA及蛋白表達(dá)水平:C組與

10、E組制模后均較N組升高，且E組更高于C組。Lgr5 mRNA表達(dá)升高，C1組vs N1組，P=0.031;E1組vs C1組，P=0.032; E2組vsC2組，P=0.005，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C2組vs N2組，P=0.264; C3組vs N3組，P=0.146，E3組vs C3組，P=0.081，不具統(tǒng)計學(xué)差異。Lgr5蛋白表達(dá)升高，C1組vs N1組，P=0.045; E1組vs C1組，P=0.036;差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C2

11、組vs N2組，P=0.062; C3組vs N3組，P=0.059; E2組vs C2組，P=0.093;E3組vs C3組，P=0.177，不具統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平:C組與E組制模后均較N組升高，且E組更高于C組。β-catenin mRNA表達(dá)升高，C1組vs N1組，P=0.039;E1組vs C1組，P=0.008; E2組vsC2組，P=0.010，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C2組v

12、s N2組，P=0.060; C3組vs N3組，P=0.200，E3組vs C3組，P=0.077，不具統(tǒng)計學(xué)差異。p-β-catenin蛋白表達(dá)升高，C1組vs N1組，P=0.013; C2組vs N2組，P=0.007; E1組vs C1組，P=0.043;差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C3組vs N3組，P=0.052; E2組vs C2組，P=0.109;E3組vs C3組，P=0.094，不具統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.PTENmRN

13、A及蛋白表達(dá)水平:C組與E組制模后均較N組下降，且E組更低于C組。PTENmRNA表達(dá)下降，C1組vs N1組，P=0.038;E1組vs C1組，P=0.003; E2組vsC2組，P=0.030; E3組vs C3組，P=0.030，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C2組vs N2組，P=0.134; C3組vs N3組，P=0.679，不具統(tǒng)計學(xué)差異。PTEN蛋白表達(dá)下降，C1組vs N1組，P=0.037; E2組vs C2組，P=0.008

14、; E3組vsC3組，P=0.048，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C2組vs N2組，P=0.123; C3組vs N3組，P=0.522，E1組vs C1組，P=0.093;不具統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.Lgr5與β-catenin mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.885，P=0.000;Lgr5與PTEN mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.877，P=0.000。Western blot Lgr5、p-β-cateni

15、n、PTEN蛋白的表達(dá)水平趨勢和Real time PCR Lgr5、β-catenin、PTEN mRNA的表達(dá)水平和相一致，Lgr5和p-β-catenin蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.789，P=0.000; Lgr5和PTEN蛋白平均水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.823，P=0.000。
　　5.PTEN蛋白的表達(dá)C3組高于C1組，P=0.022，其余Lgr5、β-catenin和PTENmRNA及蛋白表達(dá)水平

16、在各自組內(nèi)、不同時間點的變化比較均無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.腸道損傷修復(fù)期，Lgr5和β-catenin轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平升高，與修復(fù)期腸道干細(xì)胞分化、增殖增加有關(guān)。PTEN表達(dá)增加可能為機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制所致。
　　2.PTEN抑制劑通過下調(diào)PTENmRNA和蛋白表達(dá)水平，從而上調(diào)Lgr5和β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平，以促進(jìn)腸道損傷后腸干細(xì)胞的分化與增殖，加速腸粘膜損傷后修復(fù)。