蘆筍老莖栽培食用菌和培養(yǎng)料堆制過(guò)程中微生物多樣性的研究.pdf

1、蘆筍(Asparagus officinalis L.)為百合科天門冬屬多年生草本植物。在每年的蘆筍收獲季節(jié)過(guò)后，大量的蘆筍老莖沒有加以充分利用，只是任其自然腐敗，或直接焚燒，既造成資源的極大浪費(fèi)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。因此，如何合理利用蘆筍老莖這種農(nóng)業(yè)廢棄物，是一個(gè)亟待解決的問題。由于多種農(nóng)業(yè)廢棄物可以用來(lái)栽培食用菌，所以作為食用菌培養(yǎng)料是利用蘆筍老莖的有效途徑之一。本論文計(jì)劃進(jìn)行利用蘆筍老莖栽培鮑魚菇、黃白側(cè)耳和巴西蘑菇的實(shí)驗(yàn)

2、研究。重點(diǎn)針對(duì)蘆筍老莖培養(yǎng)料堆制發(fā)酵期間的微生物多樣性展開研究。蘑菇堆料是一個(gè)復(fù)雜而又獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)，內(nèi)部棲息著多種多樣的微生物。依靠微生物在適宜條件下的代謝作用，堆料中的生物大分子物質(zhì)被分解、轉(zhuǎn)化，堆料的腐熟速度和大分子物質(zhì)的降解程度都與堆料內(nèi)的微生物種類和數(shù)量直接相關(guān)。由于蘆筍老莖是一種不同于稻草、麥稈等秸稈的原料，所以其堆制發(fā)酵期間的微生物群落及其演替變化規(guī)律也必然不同于其他原料的堆料。如果要建立和完善針對(duì)蘆筍老莖的堆制發(fā)酵工藝

3、，進(jìn)而得到一種高質(zhì)量的蘑菇培養(yǎng)料，關(guān)于蘆筍老莖堆制發(fā)酵期間微生物多樣性的研究是非常必要的。在研究方法上，本論文計(jì)劃應(yīng)用16S rDNA文庫(kù)技術(shù)分析蘆筍老莖堆料微生物的多樣性，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)堆料發(fā)酵期間微生物的菌群演替進(jìn)行定量分析。本論文利用蘆筍老莖這種農(nóng)業(yè)廢棄物栽培食用菌和對(duì)蘆筍老莖堆料發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性進(jìn)行研究，是一個(gè)全新的嘗試，一方面可以填補(bǔ)關(guān)于蘆筍老莖栽培食用菌和蘆筍老莖堆料微生物多樣性的研究空白，為下一步利用

4、蘆筍老莖栽培食用菌、制備蘆筍老莖堆料發(fā)酵菌劑以及調(diào)控堆料過(guò)程提供理論依據(jù)，另一方面對(duì)于探討一條規(guī)?；锰J筍老莖資源的新途徑，促進(jìn)農(nóng)村生態(tài)循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
　　首先進(jìn)行了用蘆筍老莖栽培鮑魚菇和黃白側(cè)耳的初步研究，分析了蘆筍老莖培養(yǎng)料對(duì)鮑魚菇和黃白側(cè)耳多糖含量和抗氧化性的影響。在沒有添加其他輔料的蘆筍老莖培養(yǎng)料上，黃白側(cè)耳的產(chǎn)量（199 g/袋）比鮑魚菇的產(chǎn)量（140 g/袋）更高;在蘆筍老莖培養(yǎng)料中添加適量的葡萄糖、Mg

5、SO4和K2HPO4有利于黃白側(cè)耳子實(shí)體的發(fā)育，能導(dǎo)致黃白側(cè)耳產(chǎn)量的增加;而對(duì)于鮑魚菇來(lái)說(shuō)，在蘆筍老莖培養(yǎng)料中添加輔助性碳源和無(wú)機(jī)鹽反而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。在沒有添加其他輔料的蘆筍老莖培養(yǎng)料上，鮑魚菇子實(shí)體多糖含量明顯比黃白側(cè)耳高。與對(duì)照相比，在蘆筍老莖培養(yǎng)料中添加輔助性碳源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)黃白側(cè)耳子實(shí)體多糖含量沒有明顯的影響，但卻能導(dǎo)致鮑魚菇子實(shí)體多糖含量的顯著降低。從DPPH自由基清除能力的EC50值和還原能力的EC50值可以看出，在沒有添

6、加其他輔料的蘆筍老莖培養(yǎng)料上，鮑魚菇的抗氧化性強(qiáng)于黃白側(cè)耳;添加蔗糖和MgSO4有利于提高兩種蘑菇的抗氧化性。
　　設(shè)計(jì)了以蘆筍老莖為主料，棉籽殼、玉米芯、干牛糞和雜木屑為輔料的4種培養(yǎng)料來(lái)栽培巴西蘑菇，采用二次發(fā)酵法制備培養(yǎng)料，玉米秸稈培養(yǎng)料作為對(duì)照。結(jié)果表明巴西蘑菇在蘆筍老莖和玉米秸稈培養(yǎng)料上的產(chǎn)量沒有明顯差別;添加棉籽殼或干牛糞的蘆筍老莖培養(yǎng)料其巴西蘑菇產(chǎn)量明顯高于添加雜木屑或玉米芯的蘆筍老莖培養(yǎng)料。蘆筍老莖培養(yǎng)料上栽培得到

7、的巴西蘑菇子實(shí)體的抗氧化性明顯高于對(duì)照培養(yǎng)料上栽培得到的子實(shí)體的抗氧化性，但多糖含量卻明顯低于對(duì)照;4種輔料相比較，棉籽殼和玉米芯比干牛糞和雜木屑更有利于提高巴西蘑菇子實(shí)體的多糖含量，棉籽殼比玉米芯、干牛糞和雜木屑更有利于提高巴西蘑菇的抗氧化性。
　　采用稀釋涂布法對(duì)蘆筍老莖堆料不同發(fā)酵階段6個(gè)樣品中的嗜熱可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了分離，共分離到菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的26個(gè)細(xì)菌菌株、23個(gè)放線菌菌株和27個(gè)真菌菌株。根據(jù)16S rDNA序列

8、分析結(jié)果，26株細(xì)菌中13株為芽孢桿菌屬（Bacillus），4株為假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas），1株為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus），1株為腸桿菌屬（Enterobacter），1株為Paenibacillus屬，1株為短波單胞菌屬（Brevundimonas），1株為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），1株為Amaricoccus屬，1株為副球菌屬(Paracoccus)，2個(gè)菌株在GenB

9、ank數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到與其相似的已知細(xì)菌屬的序列，分類地位待定。根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，23株放線菌中，4株的序列與白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）同源性最高，5株的序列與熱普通鏈霉菌（Streptomyces thermovulgaris）同源性最高，2株的序列與Streptomyces pseudogriseolus同源性最高，1株的序列與Streptomyces espinosus同源性

10、最高，有11株在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到與其相似的已知鏈霉菌種的序列，分類地位待定。根據(jù)菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征觀察結(jié)果，27株真菌中12株為腐質(zhì)霉屬(Humicola)，8株為青霉屬（Penicillium），2株為鏈格孢霉屬（Alternaria），1株為擬青霉屬（Paecilomyces），4株為毛霉屬（Mucor）。從這些結(jié)果可以看出，蘆筍老莖堆料中的優(yōu)勢(shì)的嗜熱可培養(yǎng)微生物主要是芽孢桿菌（Bacillus spp.）、假黃色單

11、胞菌（Pseudoxanthomonas spp.）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）、熱普通鏈霉菌（Streptomyces thermovulgaris）、腐質(zhì)霉（Humicola spp.）、青霉（Penicillium spp.）和毛霉（Mucor spp.）。
　　為了能高效提取蘆筍老莖堆料樣品中微生物的總基因組DNA，從DNA提取和PCR擴(kuò)增效果等方面對(duì)4種DNA提取方法（即溶菌酶法

12、、蛋白酶K-CTAB法、試劑盒法和改進(jìn)的試劑盒法）進(jìn)行了比較研究。瓊脂糖凝膠電泳顯示，溶菌酶法可以提取到樣品中的基因組DNA，有一定程度的彌散，且基因組的含量較低，對(duì)蛋白質(zhì)的去除率不高。蛋白酶K-CTAB法對(duì)于基因組DNA的損傷較小，提高了蛋白質(zhì)的去除率，較好地提取到條帶單一的基因組DNA，但是濃度仍然很低。試劑盒法成功地提取到了濃度很高的基因組DNA，稍有彌散。改進(jìn)的試劑盒法也較好地提取到了基因組DNA，但是彌散得很厲害。用溶菌酶法提

13、取的基因組DNA為模板對(duì)16S rDNA片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果均無(wú)目的產(chǎn)物。用蛋白酶K-CTAB法得到的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在約1600bp處得到了目的產(chǎn)物，但是濃度卻很低。用試劑盒法提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在約1600bp處擴(kuò)增到了較濃的單一條帶，并且大小符合16S rDNA片段的理論值。用改進(jìn)的試劑盒法提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)沒有得到任何產(chǎn)物。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4種方法均可以提取到蘆筍老

14、莖堆料樣品中微生物的總基因組DNA，試劑盒法效果最好，其次是蛋白酶K-CTAB法，另外兩種方法提取效果無(wú)明顯差異;用試劑盒法提取到的總基因組DNA進(jìn)行的16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增效果最好。
　　分別構(gòu)建了蘆筍老莖堆料不同發(fā)酵階段6個(gè)樣品的細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)，并進(jìn)行了文庫(kù)中細(xì)菌多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析。共獲得228個(gè)細(xì)菌16S rDNA克隆，運(yùn)用微生物分類學(xué)和生物信息學(xué)的方法對(duì)16S rDNA克隆文庫(kù)進(jìn)行了分析，

15、結(jié)果表明:228個(gè)細(xì)菌16S rDNA克隆可分為5大類群，即變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和未確定分類地位(Unidentified)的類群。第一優(yōu)勢(shì)類群——放線菌門的16S rDNA克隆在堆料發(fā)酵的全部階段都能夠被檢出，并且占到總數(shù)的33％，表明放線菌在蘆筍老莖堆料發(fā)酵過(guò)程中起著重要的作用。第二優(yōu)勢(shì)類群——變形

16、菌門又分為α、β、γ-變形菌亞群，其中γ-變形菌亞群具有支配地位。擬桿菌16S rDNA序列在發(fā)酵中期（建堆后第11天）并沒有被克隆出來(lái)。文庫(kù)覆蓋率(Coverage C)、稀疏曲線(Rarefactioncurve)、香儂指數(shù)(Shannon-Wiener index)、物種多樣性指數(shù)（Schao(1)）和文庫(kù)相似度指數(shù)(Cs)等文庫(kù)評(píng)價(jià)指數(shù)表明，除個(gè)別文庫(kù)之外，所建文庫(kù)能較好地反映蘆筍老莖堆料中絕大部分細(xì)菌的多樣性。
　　與傳

17、統(tǒng)方法及其它微生物定量方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行直接分析，從而達(dá)到對(duì)微生物定量的目的。該方法不僅減少了培養(yǎng)計(jì)數(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)中的誤差，同時(shí)還具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、無(wú)PCR后處理的污染等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)蘆筍老莖堆料不同發(fā)酵階段的3種嗜熱放線菌進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，Thermobifida fusca、白淺灰鏈霉菌（Streptomycesalbogriseolus）和熱普通鏈霉菌（S

18、treptomyces thermovulgaris）在整個(gè)堆料發(fā)酵過(guò)程中始終存在。其中，Thermobifida fusca和熱普通鏈霉菌在發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)量變化近似一條鐘形曲線，即發(fā)酵初期遞增，發(fā)酵中后期逐漸降低，它們的動(dòng)態(tài)變化非常符合一般堆料發(fā)酵中嗜熱放線菌的菌群演替過(guò)程。特別是Thermob ifida fusca表現(xiàn)得尤為明顯，頂峰時(shí)期（發(fā)酵中期）的菌群數(shù)量達(dá)到3.45×107/g堆料，約為發(fā)酵初期和后期的103～104倍，在所