牛糞高溫堆肥過程中的物質(zhì)變化、微生物多樣性以及腐熟度評價研究.pdf

1、好氧高溫堆肥是一種經(jīng)濟、環(huán)保的農(nóng)業(yè)固體有機廢棄物資源化利用的手段。高溫堆肥過程中的物質(zhì)變化與腐熟度評價以及微生物多樣性的研究一直以來都是國內(nèi)外關(guān)注的熱點，它們與堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量和堆肥發(fā)生的機理密切相關(guān)，對堆肥的生產(chǎn)具有指導意義。但是，文獻報道的大多數(shù)堆肥腐熟度的評價指標測定起來比較復(fù)雜，不利于中小型堆肥企業(yè)的實際應(yīng)用。另外，對于堆肥過程中微生物多樣性的研究更多的是以實驗室規(guī)模的小型發(fā)酵試驗為主，而對于企業(yè)應(yīng)用較多的傳統(tǒng)條垛堆肥發(fā)酵關(guān)注較少

2、，并且分析方法也有一定的缺陷。因此，本文以牛糞和水稻秸稈為原料進行了高溫條垛堆肥的發(fā)酵，對堆肥過程中的物質(zhì)變化與腐熟度評價以及微生物多樣性進行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過對堆肥過程中的部分物理指標、化學指標和生物指標的研究表明整個堆肥過程可以明顯的分為升溫（0-12天）、高溫（22-52天）和降溫腐熟（62-112天）三個不同的階段，有機物質(zhì)的降解和水分的蒸發(fā)等主要發(fā)生在堆肥的升溫和高溫階段(0-52天)，而硝化作

3、用和腐殖化作用主要發(fā)生在堆肥的降溫和腐熟階段。以測得的各種理化指標進行腐熟度評價發(fā)現(xiàn)單個指標并不能很好的評估堆肥的腐熟程度，必須兩個或兩個以上的指標相結(jié)合。以發(fā)芽指數(shù)(GI)為標準進行相關(guān)性分析表明C/N、OM損失扣NH4+-N/NO3--N是更為可靠的牛糞堆肥腐熟度的評價指標;各指標綜合評價表明以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥62天以后已經(jīng)達到腐熟。
　　 2.三維熒光光譜與熒光區(qū)域指數(shù)（EEM-FRI）的研究結(jié)果表明在牛糞高溫堆

4、肥過程中，蛋白質(zhì)的含量逐漸低，而腐殖酸和富里酸的含量則逐漸上升;通過EEM-FRI與堆肥過程中的理化指標以及生物指標的相關(guān)性分析確定，EEM-FRI與大部分常用的評價堆肥腐熟度的理化指標都顯著相關(guān)，因此可以用于評價牛糞堆肥的腐熟度，并且具有簡單、快速的特點。紅外光譜的分析結(jié)果則顯示隨著堆肥的進行，不同時期堆肥樣品的紅外光譜的峰所在的區(qū)域變化不大，只是峰的強度變化較大。
　　 3.分別對五種不同的堆肥DNA提取方法進行了細胞破壁效

5、率、DNA和腐殖酸產(chǎn)量、PCR擴增和微生物多樣性等方面的比較，建立了一種適合以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥樣品的DNA提取和純化方法FTSPP。FTSPP法的細胞破壁效率達到了94.6％，純DNA的產(chǎn)量達到了33.19μg/g dw，并且在1μg/μl牛血清白蛋白(BSA)存在的條件下成功的進行了PCR擴增，并且通過熒光定量PCR和DGGE分析表明， FTSPP法提取的DNA獲得的細菌和放線菌的16S rRNA的拷貝數(shù)以及DGGE條帶數(shù)均

6、高于其他方法。
　　 4.通過平板培養(yǎng)技術(shù)對牛糞高溫堆肥過程中的常溫(30℃)和高溫(55℃)微生物的數(shù)量進行了研究，結(jié)果表明無論常溫還是高溫可培養(yǎng)微生物的數(shù)量在堆肥過程中均經(jīng)歷了一個先增加再降低然后再增加的變化趨勢，常溫細菌和放線菌的數(shù)量在第22天達到最大值，分別為9.331g CFU/g dw和7.181g CFU/g dw，而常溫真菌則在第12天達到最大值，為5.121g CFU/g dw;高溫細菌和放線菌數(shù)量最大值出現(xiàn)的

7、時間比常溫微生物明顯滯后，均在第32天獲得最大值，1g CFU/g dw分別為7.17和5.78，而高溫真菌在第22天達到最大值，1g CFU/g dw為3.24。
　　 根據(jù)DGGE的研究結(jié)果可將整個堆肥過程分為0-12天、22-52天和62-112天三個與根據(jù)溫度劃分相一致的階段，在堆肥前期（0-12天）微生物種類變化最劇烈，但總體呈現(xiàn)先上升再下降最后再上升的變化趨勢，并且高溫階段的樣品與降溫腐熟階段的樣品的相似性要高于升溫

8、階段的樣品。成功測序的DGGE條帶的序列比對結(jié)果顯示，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria和Actinobacteria是堆肥過程中主要的微生物門類，條帶M和條帶X均與Bacillus屬微生物表現(xiàn)出了較高相似性(99％)，條帶S則與Streptomyces sp.(EF012138)表現(xiàn)出了100％的序列相似性，另外，大部分為未培養(yǎng)的微生物。根據(jù)FRI參數(shù)與堆肥過程中細菌的種類變化的相關(guān)性分析發(fā)

9、現(xiàn)PⅡ,n和PⅣ,n與堆肥過程中細菌的種類變化的相關(guān)系數(shù)分別達到了0.907和0.949，進一步的線性回歸分析證明PⅣ,n是更可靠地評價以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥過程中細菌種類變化的參數(shù)。
　　 分別對0、12、42和112天的堆肥樣品進行了16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建和序列分析，成功測序的779個克隆的Genebank登陸號為JQ336994-JQ337772。多樣性分析表明四個時間段的Shannon-Wienner指

10、數(shù)分別為2.64、3.25、3.18和4.05。序列分析顯示Frimicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi門的微生物在堆肥過程中普遍存在，而Actinobacteria則只存在于堆肥的高溫階段（42天），并且第一次在堆肥后期樣品中（112天）發(fā)現(xiàn)了BCR1門的微生物。Arthrobacter屬的克隆數(shù)在高溫階段的樣品中（42天）含量最高，達到了21.74％;而Bacillus和Ba

11、cillus相關(guān)的屬包括Soilbacillus，Aneurinibacillus，Marinibacillus和Ureibacillus的相對含量為8.70％，在第112天更是達到了10.25％;另外，第112天的樣品中，伴隨著新的屬包括Flavobacterium，Parapedobacter，Nitrosomonas，Ochrobactrum和Rhizobium的出現(xiàn);所有文庫中有相當一部分序列屬于未分類微生物，并且隨著堆肥的進行

12、它們所占的比例越來越高。
　　 5.從第82天的新鮮堆肥樣品中經(jīng)過富集、初篩和復(fù)篩成功的分離到兩株具有較高纖維素酶活的細菌菌株T1和T2，結(jié)合生理生化和16S rRNA基因序列分析分別鑒定為Bacillus cereus和Bacillus subtilis。根據(jù)NCBI報道的Bacillus subtilis葡聚糖內(nèi)切酶基因設(shè)計引物，克隆到Bacillus subtilis T2的葡聚糖內(nèi)切酶基因，與報道的內(nèi)切酶基因均具有99％