土壤中抗生素產(chǎn)生菌的基因篩選方法建立.pdf

1、從抗生素進(jìn)入臨床50多年來(lái)，抗生素篩選取得了巨大成就，挽救了無(wú)數(shù)人的生命。從微生物中尋找新抗生素是目前抗生素的主要來(lái)源。然而傳統(tǒng)新抗生素篩選方法工作量大、周期長(zhǎng)，尋找新物質(zhì)越來(lái)越難。目前，許多抗生素生物合成途徑化學(xué)結(jié)構(gòu)與目的基因相互關(guān)系研究透徹，為本研究奠定了基礎(chǔ)。本論文首次建立了從土壤中直接提取純化DNA，利用特異引物進(jìn)行PCR.擴(kuò)增的方法快速定向抗生素的篩選方法。
　　 本研究課題建立了5種從土壤中直接提取DNA的方法：改進(jìn)

2、的Zhou法、改進(jìn)的Bathe法、PVP法、改進(jìn)的Marc法、液氮冷凍法；建立了3種土壤DNA純化方法：SephadexG-75/PVPP溶液法、膠回收試劑盒法、PVPP柱層析法。經(jīng)過(guò)比較，最終確立了液氮冷凍法和PVPP柱層析法作為簡(jiǎn)單快速?gòu)奶崛〖兓寥涝宋⑸锘蚪MDNA的方法。純化后每克土壤可提取21.27～41.68/μg DNA。
　　 摻菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了篩選方法的靈敏性。摻菌實(shí)驗(yàn)將摻入滅菌土壤中的菌株N022507平板計(jì)

3、數(shù)，液氮冷凍法和PVPP柱層析法提取純化后PCR擴(kuò)增。每克土壤可以檢測(cè)到103個(gè)菌。證明了本研究的提取純化方法具有較高的靈敏度。
　　 利用SSCP方法驗(yàn)證了篩選方法的靈敏性和多樣性。將10株菌提取的DNA為模板的PCR產(chǎn)物與10株菌摻入到滅菌土壤中再提取、純化DNA為模板的PCR產(chǎn)物做SSCP，二者的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶相似，無(wú)明顯差別。說(shuō)明提取純化土壤DNA的方法得’到的DNA的多樣性較好，可將不同菌的DNA從土壤中提取純

4、化出來(lái)。
　　 利用整個(gè)篩選過(guò)程的模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選方法的可行性。在對(duì)整個(gè)篩選過(guò)程的模擬實(shí)驗(yàn)中分別在土壤中摻入了除莠霉素產(chǎn)生菌N022507和格爾德霉素產(chǎn)生菌N062821，從土壤中提取純化DNA作為模板均可用特異引物PCR.擴(kuò)增證明為陽(yáng)性。而且從摻菌的土壤中可以分離菌得到了N022507和N062821。
　　 隨機(jī)摻入陽(yáng)性菌株的土樣的篩選實(shí)驗(yàn)將無(wú)標(biāo)記的7份土壤樣品中的1份摻入N022507，篩選得到了1個(gè)陽(yáng)性結(jié)