雄黃對發(fā)育中的大鼠腦組織內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響.pdf

1、前言:
　　 雄黃(Realgar),系硫化物類礦物雄黃族雄黃的礦石,味辛、溫,有毒,歸心,肝,胃經(jīng),用于解毒殺蟲,燥濕,去痰,截瘧等。在現(xiàn)行四大國家標(biāo)準(zhǔn)收載的全部中藥制劑中,含雄黃的制劑多達(dá)2.80%(194/6938)。同時(shí)雄黃也是《醫(yī)療用藥毒性藥品管理辦法》特別規(guī)定的28種毒性中藥之一。近年長期、超量和不規(guī)范使用單味雄黃或其復(fù)方制劑引起不良反應(yīng)或慢性砷中毒事件時(shí)有報(bào)道,其中不少是新生兒、少兒濫用所致,因而雄黃對人體健康的影

2、響成為了人們近年來關(guān)注的焦點(diǎn)。雄黃主要成分為二硫化二砷(As2S2)或四硫化四砷(As4S4),含有少量As2O3[iAs(Ⅱ),即砒霜]和As2O5[iAs(Ⅴ)]。無機(jī)砷在體內(nèi)經(jīng)過氧化甲基化和還原,可產(chǎn)生多種甲基化代謝產(chǎn)物[—甲基胂酸(monomethyl-arsenicacid,MMA),二甲基胂酸(di-methylarsenicacid,DMA)等],其中MMA(Ⅲ)的急性毒性最強(qiáng),是iAs(Ⅲ)的4倍,這些代謝產(chǎn)物隨血液分布

3、到全身各組織器官或系統(tǒng),造成機(jī)體損傷。流行病學(xué)調(diào)查顯示長期暴露砷的兒童注意力、語言能力和長期記憶力均下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,砷是一種發(fā)育毒物,可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織并蓄積,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的智力和認(rèn)知能力等學(xué)習(xí)和記憶方面的障礙。因此,闡明雄黃損害學(xué)習(xí)記憶功能及其毒作用機(jī)制對于早期采取有效措施保護(hù)少年兒童健康具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
　　 材料與方法:
　　 中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供4周齡Wistar大鼠64只,體重50±1

4、0g,雌雄各半,正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按體重隨機(jī)分成8組,每組8只,以0.5%CMC-Na水溶液為混懸介質(zhì),1-2組為低劑量組灌胃給藥劑量為0.3g/kg,第3-4組為中劑量組給藥劑量為0.9g/kg,第5-6組為高劑量組給藥劑量為2.7g/kg,7-8組為對照組(0.5%CMC-Na水溶液),每個(gè)劑量組內(nèi)的2個(gè)小組分別飼養(yǎng)2、6周。每日1次,在動(dòng)物灌胃期間每3天稱重1次,調(diào)節(jié)灌胃劑量。所有動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食普通飼料。最后一次灌胃

5、2h后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,迅速開顱取大腦待用(冰浴下進(jìn)行)。
　　 第一部分實(shí)驗(yàn):采用冷阱捕集.氫化物發(fā)生.原子吸收法測定雄黃染毒2周大鼠腦組織中形態(tài)砷的含量,雄黃染毒6周大鼠腦組織和血中形態(tài)砷的含量。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn):采用柱前衍生化-高效液相色譜紫外檢測法測定雄黃染毒2周、6周后,大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量及方法學(xué)考察。
　　 結(jié)果:
　　 在大鼠血液中檢測到iAs、MMA和D

6、MA,而腦組織中僅檢測到MMA和DMA,未檢測到iAs。雄黃灌胃2周和6周后,與對照組比較,各劑量組大鼠腦組織中MMA、DMA和Tas含量水平均顯著增加(P<0.01,P<0.05)。比較染毒6周和2周大鼠腦組織中蓄積的砷量,發(fā)現(xiàn)6周大鼠腦組織中砷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2周大鼠腦組織中的砷含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雄黃代謝產(chǎn)物MMA和DMA可通過血腦屏障在腦組織中蓄積,腦中砷代謝速度較慢,并且腦中MMA、DMA和Tas的量隨著雄黃染毒劑量的增加和染毒時(shí)間

7、的延長而升高,說明長期服用雄黃易于引起慢性砷中毒。
　　 實(shí)驗(yàn)表明,幼鼠連續(xù)染毒2周后,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)高劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中興奮性氨基酸Asp含量與對照組比明顯降低(P<0.05);但低劑量雄黃染毒組大鼠腦組織中抑制性氨基酸GABA和Tau含量明顯高于對照組(P<0.05)。連續(xù)灌胃6周后,與對照組比較,Asp和Glu在雄黃染毒組大鼠腦組織中的含量均明顯減少(P<0.05)。染毒組大鼠腦組織中抑制性氨基酸Gly含量減少,低

8、劑量和高劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GABA在低、中劑量組含量低于對照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各染毒劑量組大鼠腦組織中Tau含量水平與對照組比也顯著降低(P<0.05)。
　　 比較染毒2周和染毒6周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)Asp在染毒2周后高劑量組明顯降低,染毒6周后低、中、高劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內(nèi)Gly在染毒2周后,有降低趨勢,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內(nèi)G

9、ly在染毒2周后,低、中劑量組含量均增加,但低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高劑量組的含量明顯降低,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05);大鼠腦內(nèi)GABA在染毒2周后,低劑量組含量增加(p<0.05),中、高劑量組的含量稍又降低,染毒6周后各劑量組均均降低,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;大鼠腦內(nèi)Tau在染毒2周后,低劑量組含量顯著增加(p<0.05),中、高劑量組的含量雖有降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,染毒6周后各劑量組均明顯降低(p<0.05)。灌胃2周后

10、染毒組大鼠興奮性氨基酸和抑制性氨基酸平衡常數(shù)K與對照組比有降低趨勢,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;灌胃6周后,染毒組大鼠平衡常數(shù)K與對照組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明長期服用雄黃可引起氨基酸代謝平衡失調(diào)。
　　 建立了柱前衍生化的HPLC法測定大鼠腦中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的方法,經(jīng)方法學(xué)考察該方法結(jié)果發(fā)現(xiàn)以pH9.5的碳酸鹽為衍生化緩沖液,與0.2mL10mmol/L的丹磺酰氯在65℃反應(yīng)25min的條件下各氨基酸的衍生化效率最

11、大,該方法重復(fù)性、日間精密度良好。衍生化后的腦組織樣品在12h內(nèi)、3次凍融循環(huán)及-70。C條件下貯存20天后5種氨基酸均很穩(wěn)定,其回收率在87.7%-107.2之間,表明該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠、檢出限低。
　　 結(jié)論:
　　 1、雄黃在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為iAs、MMA和DMA,并且以DMA為主。其中MMA和DMA可以通過血腦屏障進(jìn)入并蓄積腦中,并且腦中MMA、DMA和Tas的量隨著雄黃染毒劑量的增加和時(shí)間的延長而升高。