微溝槽鈦表面抗菌肽生物涂層的抗菌性能及其對牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、種植體頸部與植體周圍軟組織形成的軟組織封閉對種植體長期成功率極為重要，它也是預(yù)防種植體周圍炎重要因素之一。根據(jù)“the race for the surface”理論，在種植體生物材料的表面，細(xì)菌的粘附和組織的結(jié)合存在一個競爭的關(guān)系。如果組織細(xì)胞在競爭中占優(yōu)那么就能形成良好的組織整合，反之亦然。因此為了形成一個良好的、有功能的軟組織封閉，種植體頸部需具備以下兩個性能：1、種植體頸部需對牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）具有較好的粘附和增殖誘導(dǎo)作

2、用；2、種植體頸部需具備良好的抗菌性能。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)，微溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面能夠?qū)е滤^的“接觸誘導(dǎo)”，有利于HGFs的粘附、增殖，同時促進(jìn)各種基因和蛋白的表達(dá)。大部分研究認(rèn)為60μm寬、10μm深的微溝槽最適合種植體頸部設(shè)計。近年來抗菌肽的出現(xiàn)為種植體表面抗菌涂層的研究帶來了新的思路，抗菌肽具有抗菌譜廣、無組織細(xì)胞毒性、細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等特點。通過將抗菌肽修飾到溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面，可以將兩者結(jié)合起來并各自發(fā)揮其作用，形成良好的

3、軟組織封閉。
　　目的：
　　本課題通過3-氯丙基三乙氧基硅烷（CPTES）硅烷化這一生物活化方法將抗菌肽修飾到具有60μm寬、10μm深的微溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面，通過檢測其理化性能確定其是否修飾成功，同時檢測其機械穩(wěn)定性；通過體外細(xì)菌培養(yǎng)觀察其對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果；通過體外細(xì)胞培養(yǎng)評價其對HGFs的粘附、增殖的影響，并觀察微溝槽結(jié)構(gòu)所具有的“接觸誘導(dǎo)”效應(yīng)。
　　方法：
　　利用硅烷化的方法將抗菌肽GL13K

4、共價修飾到微溝槽鈦表面，通過X線能譜儀、場發(fā)射掃描電鏡、原子力顯微鏡、接觸角檢測儀等對材料表面的元素成分、形貌、粗糙度及潤濕性等理化性能進(jìn)行檢測，判斷其修飾成功與否。修飾成功后通過比較物理吸附和硅烷化修飾抗菌肽在超聲2h前后的抗菌肽熒光變化、表面元素的變化、接觸角變化情況來檢查其機械穩(wěn)定性。將牙齦卟啉單胞菌接種到不同材料表面，通過吖啶橙染色檢測粘附能力、平板計數(shù)檢測殺菌能力、細(xì)菌活性檢測等評價抗菌肽涂層的抗菌性能。將HGFs接種到不同材

5、料表面，通過DAPI染色檢測細(xì)胞的粘附能力、CCK8檢測細(xì)胞增殖能力、免疫熒光和掃描電鏡檢測細(xì)胞形態(tài)和接觸誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　?。?）理化性能檢測：微溝槽表面硅烷化修飾抗菌肽后，XPS顯示其表面出現(xiàn)了抗菌肽所特有的N元素，且C元素的含量明顯增加，證明了抗菌肽成功修飾。修飾后鈦表面的粗糙度由原來的1.71±0.05nm增加到28.86±4.48nm；接觸角由60.68±2.89?增加到101.6±6.75?，因此，修飾了

6、抗菌肽GL13K的微溝槽鈦表面表現(xiàn)為疏水性且更為粗糙。涂層機械穩(wěn)定性檢測：硅烷化后修飾抗菌肽的材料超聲2h前后，其表面標(biāo)記FITC熒光的抗菌肽幾乎沒有變化；而直接物理吸附抗菌肽的材料超聲2h前后，其表面標(biāo)記FITC熒光的抗菌肽明顯減少，XPS與接觸角檢測的結(jié)果與熒光結(jié)果相似，都證明了硅烷化修飾的抗菌肽涂層具有機械穩(wěn)定性。
　　（2）抗細(xì)菌粘附：在不同的材料表面接種相同濃度的牙齦卟啉單胞菌，分別培養(yǎng)12h、24h、72h后吖啶橙染色

7、結(jié)果顯示光滑、微溝槽、抗菌肽涂層的光滑或微溝槽材料表面其細(xì)菌的數(shù)量大致一樣，說明在微溝槽鈦表面增加的抗菌肽涂層并沒有抗細(xì)菌粘附的性能。殺菌試驗：將粘附在材料表面的細(xì)菌離心后稀釋，接種到BHI瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，三個時間段都顯示具有抗菌肽涂層的微溝槽材料表面的CFUs明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。細(xì)菌代謝活性：細(xì)菌在材料表面培養(yǎng)三個時間段后，進(jìn)行WST-8生物活性測試，發(fā)現(xiàn)具有抗菌肽涂層的微溝槽材料表面的OD值明顯減少，差

8、異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），與CFUs的結(jié)果幾乎一致。證明了抗菌肽GL13K修飾到微溝槽材料表面后仍有很好的殺菌作用。
　　（3）細(xì)胞粘附：用DAPI染料對接種在光滑、微溝槽、抗菌肽涂層的微溝槽材料表面2h、4h、6h后的HGFs細(xì)胞核進(jìn)行染色，并在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)2h時三種材料表面的細(xì)胞數(shù)量無差異；4h、6h時微溝槽組與抗菌肽涂層的微溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)量均多于光滑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）

9、；6h時抗菌肽涂層的微溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)量又多于溝槽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞增殖：所有時段抗菌肽涂層的微溝槽組表面細(xì)胞數(shù)量多于微溝槽組，且微溝槽組又多于光滑組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。細(xì)胞形態(tài)和排列方向：微溝槽組和抗菌肽涂層的微溝槽組的HGFs呈細(xì)長型并沿著溝槽的方向平行排列，而光滑組的細(xì)胞呈橢圓形、不規(guī)則排列。
　　結(jié)論：
　　采用CPTEs硅烷化的方法將抗菌肽GL13K穩(wěn)定地修飾在