化學(xué)酶法合成氟代Thomsen-Friedenreich(T)抗原及其唾液酸化衍生物.pdf

1、細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)腫瘤相關(guān)糖抗原(tumor-associatedcarbohydrateantigens，TACAs)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的普遍現(xiàn)象。近二十年來(lái)，基于TACAs而進(jìn)行的抗腫瘤疫苗的合成與研發(fā)成為國(guó)際糖科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。基于天然TACAs設(shè)計(jì)的疫苗研究取得了許多突破性的成果，然而絕大多數(shù)這類(lèi)糖疫苗由于不能激起機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫反應(yīng)未能通過(guò)臨床試驗(yàn)。天然TACAs的低免疫原性主要?dú)w咎于其在人機(jī)體正常組織存在著低水平表

2、達(dá)，因而被機(jī)體視為“自己”的內(nèi)源性物質(zhì)。此外，TACAs對(duì)內(nèi)源性的糖苷酶等敏感，容易被降解導(dǎo)致部分疫苗丟失了糖抗原的完整性，進(jìn)而降低了其激發(fā)特異性免疫反應(yīng)的能力。為了克服上述問(wèn)題，對(duì)TACAs進(jìn)行非天然修飾逐漸成為一個(gè)有效的解決途徑。目前常見(jiàn)的非天然改造方法有在天然TACAs中引入氟代脫氧糖、碳苷以及硫苷等。
　　 Thomsen-Friedenreich抗原(TF或T抗原，Galβ1，3GalNAcαSer/Thr)是最為常見(jiàn)

3、的TACAs之一，在90％的腫瘤細(xì)胞表面均存在過(guò)度表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌等。近來(lái)有報(bào)道將引入氟取代的T-MUC1糖蛋白類(lèi)似物應(yīng)用于抗腫瘤疫苗的研究，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了高強(qiáng)度和專(zhuān)一的免疫反應(yīng)。這是由于氟基團(tuán)的引入不僅會(huì)增強(qiáng)T抗原的免疫原性，同時(shí)也有效的改善了其代謝穩(wěn)定性、脂溶性和生物利用度。盡管氟代策略在藥物研發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，且多氟代藥物（如LipitorTM，ProzacTM等）在全球藥物銷(xiāo)售額排名中領(lǐng)先，但是卻

4、只有極少的氟代寡糖，包括氟代T抗原及其類(lèi)似物被合成。這主要是由于氟代T抗原和其它類(lèi)型含有β1，3-半乳糖苷鍵寡糖的化學(xué)或酶法合成上的挑戰(zhàn)性所導(dǎo)致的。氟代寡糖的合成不僅需要反復(fù)的保護(hù)和脫保護(hù)操作，而且氟代糖砌塊的反應(yīng)活性較其相應(yīng)的天然糖砌塊大大降低，因而氟代糖砌塊涉及的寡糖化學(xué)合成通常需要在劇烈反應(yīng)條件下（如微波協(xié)助，加熱等）才能進(jìn)行，這使得氟代寡糖的合成效率低，總收率不高。因此，迫切地需要發(fā)展一個(gè)快速、高效、可行的合成策略，來(lái)大量獲取氟

5、代T抗原及其類(lèi)似物用于進(jìn)一步的疫苗活性評(píng)價(jià)。
　　 本論文成功發(fā)展了一個(gè)以來(lái)自于雙歧桿菌（Bifidobacteriuminfantis）的D-半乳糖-1，3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和來(lái)自于大腸桿菌K-12(E.coliK-12)的重組半乳糖激酶(EcGalK)催化的一鍋雙酶反應(yīng)策略來(lái)合成不同類(lèi)型的β1，3-半乳糖苷鍵。與半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化的糖苷化反應(yīng)相比，BiGalHexNAcP催化成苷反應(yīng)直接

6、利用半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P)為糖基供體;不需要使用價(jià)格昂貴的核苷酸活化的半乳糖(UDP-Gal)給體。另外，我們應(yīng)用的兩個(gè)酶EcGalK和BiGalHexNAcP，均能夠在重組大腸桿菌E.coli中獲得較高的表達(dá)量，能夠?yàn)榇罅亢铣商峁┳銐虻拿?。并且BiGalHexNAcP的天然催化底物中也表現(xiàn)出了對(duì)N-乙酰氨基半乳糖C6-位修飾的一定耐受。因此我們發(fā)展的“連續(xù)‘一鍋雙酶法'”合成能夠應(yīng)用于大規(guī)模氟代T抗原及其類(lèi)似物的合成。同時(shí)

7、，所合成的氟代T抗原及其類(lèi)似物可以作為我們所發(fā)展的另一個(gè)“一鍋雙酶”體系的底物，以高于90％的收率合成系列唾液酸化氟代T抗原。
　　 本課題研究取得的主要成果包括以下幾方面。
　　 (1)成功地發(fā)展出新型“連續(xù)‘一鍋雙酶法'寡糖合成策略”，該策略將成為我們未來(lái)合成工作中的一個(gè)強(qiáng)有力工具，并有望實(shí)現(xiàn)較大范圍的推廣應(yīng)用，為制約糖生物學(xué)和糖化學(xué)生物學(xué)發(fā)展的寡糖來(lái)源問(wèn)題帶來(lái)新的解決途徑;
　　 (2)世界上首次成功地運(yùn)用

8、“連續(xù)‘一鍋雙酶法'寡糖合成策略”，實(shí)現(xiàn)了氟代T抗原系列寡糖的大量、快速、高效合成;
　　 (3)首次成功地實(shí)現(xiàn)了氟代T抗原的快速、高效“一鍋雙酶法”唾液酸化修飾;
　　 (4)世界上首次人工合成唾液酸化氟代T抗原系列TACAs類(lèi)似物;
　　 (5)本課題高效合成了系列氟代T抗原，說(shuō)明BiGalHexNAcP具有一定波動(dòng)范圍的底物適應(yīng)性，能夠很好地耐受供體與受體上C6-位氟取代修飾;
　　 (6)本課題中