化學酶法合成氟代Thomsen-Friedenreich(T)抗原及其唾液酸化衍生物.pdf

1、細胞表面過度表達腫瘤相關糖抗原(tumor-associatedcarbohydrateantigens，TACAs)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象。近二十年來，基于TACAs而進行的抗腫瘤疫苗的合成與研發(fā)成為國際糖科學領域的一個研究熱點?；谔烊籘ACAs設計的疫苗研究取得了許多突破性的成果，然而絕大多數(shù)這類糖疫苗由于不能激起機體產(chǎn)生足夠的免疫反應未能通過臨床試驗。天然TACAs的低免疫原性主要歸咎于其在人機體正常組織存在著低水平表

2、達，因而被機體視為“自己”的內(nèi)源性物質(zhì)。此外，TACAs對內(nèi)源性的糖苷酶等敏感，容易被降解導致部分疫苗丟失了糖抗原的完整性，進而降低了其激發(fā)特異性免疫反應的能力。為了克服上述問題，對TACAs進行非天然修飾逐漸成為一個有效的解決途徑。目前常見的非天然改造方法有在天然TACAs中引入氟代脫氧糖、碳苷以及硫苷等。
　　 Thomsen-Friedenreich抗原(TF或T抗原，Galβ1，3GalNAcαSer/Thr)是最為常見

3、的TACAs之一，在90％的腫瘤細胞表面均存在過度表達，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌等。近來有報道將引入氟取代的T-MUC1糖蛋白類似物應用于抗腫瘤疫苗的研究，并在動物實驗中獲得了高強度和專一的免疫反應。這是由于氟基團的引入不僅會增強T抗原的免疫原性，同時也有效的改善了其代謝穩(wěn)定性、脂溶性和生物利用度。盡管氟代策略在藥物研發(fā)領域得到了廣泛應用，且多氟代藥物（如LipitorTM，ProzacTM等）在全球藥物銷售額排名中領先，但是卻

4、只有極少的氟代寡糖，包括氟代T抗原及其類似物被合成。這主要是由于氟代T抗原和其它類型含有β1，3-半乳糖苷鍵寡糖的化學或酶法合成上的挑戰(zhàn)性所導致的。氟代寡糖的合成不僅需要反復的保護和脫保護操作，而且氟代糖砌塊的反應活性較其相應的天然糖砌塊大大降低，因而氟代糖砌塊涉及的寡糖化學合成通常需要在劇烈反應條件下（如微波協(xié)助，加熱等）才能進行，這使得氟代寡糖的合成效率低，總收率不高。因此，迫切地需要發(fā)展一個快速、高效、可行的合成策略，來大量獲取氟

5、代T抗原及其類似物用于進一步的疫苗活性評價。
　　 本論文成功發(fā)展了一個以來自于雙歧桿菌（Bifidobacteriuminfantis）的D-半乳糖-1，3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和來自于大腸桿菌K-12(E.coliK-12)的重組半乳糖激酶(EcGalK)催化的一鍋雙酶反應策略來合成不同類型的β1，3-半乳糖苷鍵。與半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化的糖苷化反應相比，BiGalHexNAcP催化成苷反應直接

6、利用半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P)為糖基供體;不需要使用價格昂貴的核苷酸活化的半乳糖(UDP-Gal)給體。另外，我們應用的兩個酶EcGalK和BiGalHexNAcP，均能夠在重組大腸桿菌E.coli中獲得較高的表達量，能夠為大量合成提供足夠的酶。并且BiGalHexNAcP的天然催化底物中也表現(xiàn)出了對N-乙酰氨基半乳糖C6-位修飾的一定耐受。因此我們發(fā)展的“連續(xù)‘一鍋雙酶法'”合成能夠應用于大規(guī)模氟代T抗原及其類似物的合成。同時

7、，所合成的氟代T抗原及其類似物可以作為我們所發(fā)展的另一個“一鍋雙酶”體系的底物，以高于90％的收率合成系列唾液酸化氟代T抗原。
　　 本課題研究取得的主要成果包括以下幾方面。
　　 (1)成功地發(fā)展出新型“連續(xù)‘一鍋雙酶法'寡糖合成策略”，該策略將成為我們未來合成工作中的一個強有力工具，并有望實現(xiàn)較大范圍的推廣應用，為制約糖生物學和糖化學生物學發(fā)展的寡糖來源問題帶來新的解決途徑;
　　 (2)世界上首次成功地運用

8、“連續(xù)‘一鍋雙酶法'寡糖合成策略”，實現(xiàn)了氟代T抗原系列寡糖的大量、快速、高效合成;
　　 (3)首次成功地實現(xiàn)了氟代T抗原的快速、高效“一鍋雙酶法”唾液酸化修飾;
　　 (4)世界上首次人工合成唾液酸化氟代T抗原系列TACAs類似物;
　　 (5)本課題高效合成了系列氟代T抗原，說明BiGalHexNAcP具有一定波動范圍的底物適應性，能夠很好地耐受供體與受體上C6-位氟取代修飾;
　　 (6)本課題中