基于“微者逆之,甚者從之”理論探討“回陽(yáng)方”干預(yù)急性肝衰竭大鼠陰陽(yáng)離決的抗炎免疫分子機(jī)制.pdf

1、目的：建立由D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠模型，觀察“回陽(yáng)方”對(duì)急性肝衰竭大鼠肝功能、病理學(xué)及生存期的影響，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探討其抗肝衰竭的抗炎免疫分子機(jī)制，為肝衰竭的防治開拓新思路并提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：通過(guò)單次腹腔注射不同劑量的D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）確定構(gòu)建急性肝衰竭(ALF)大鼠模型的最佳劑量。70只體重為180±20g的雌性SD大鼠以是否接受造模和不同的藥物干預(yù)隨機(jī)分為四組

2、：空白組、模型組、復(fù)方甘草酸苷組（美能組）和回陽(yáng)方組（實(shí)驗(yàn)組）。其中空白組含10只大鼠，不接受 D-GalN造模，以等劑量的生理鹽水代替，腹腔注射前3天給予蒸餾水10ml/kg/d灌胃。模型組含20只大鼠，接受D-GalN造模，造模前3天給予蒸餾水10ml/kg/d灌胃。美能組含20只大鼠，接受D-GalN造模，造模前3天給予成人等效臨床劑量的美能15.6mg/kg/d灌胃。實(shí)驗(yàn)組含20只大鼠，接受 D-GalN造模，造模前3天給予成人

3、等效臨床劑量的“回陽(yáng)方”18.8g/kg/d灌胃。灌胃持續(xù)5天。造模后36 h經(jīng)大鼠股動(dòng)脈取血4ml置于干燥管中,另取2ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中,均在3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下進(jìn)行離心10分鐘，置血清于-20℃保存以備檢測(cè)ALT、AST、TBIL、ALB、CHE及PT水平。取血后斷頸處死大鼠，并取肝組織，置于10％中性福爾馬林液固定后放至-70攝氏度的冰箱儲(chǔ)存，用于：常規(guī) HE染色肝組織病理學(xué)觀察，并記錄病理評(píng)分；實(shí)時(shí)熒光定量 PT-PC

4、R檢測(cè)TLR4、NF-κB、HMGB1和caspase-3的表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) PCNA表達(dá)水平。另有55只體重為180±20g的雌性SD大鼠以用樣的造模及給藥方案隨機(jī)分為空白組、模型組、美能組和實(shí)驗(yàn)組，各組大鼠的只數(shù)分別為10、15、15、15只。本組用于觀察造模后大鼠的一般情況、行為學(xué)改變和生存期，并描繪生存曲線。觀察時(shí)間點(diǎn)為腹腔注射伊始到注射后96小時(shí)。
　　結(jié)果：⑴預(yù)實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)ALF的最佳造模劑量為1.4g/

5、kg。⑵一般情況：腹腔注射D-GalN后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲下降、行為遲鈍及對(duì)刺激的靈敏度下降等一系列行為學(xué)改變，同時(shí)誘發(fā)尿失禁，尿黃，精神不振，嗜睡，煩躁，抽搐，出血等嚴(yán)重癥狀。與模型組相比，經(jīng)“回陽(yáng)方”治療后，實(shí)驗(yàn)組大鼠上述癥狀均明顯減輕，且更重要的是，在治療過(guò)程中沒有發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。⑶生存期：腹腔注射后96小時(shí)，模型組、美能組、實(shí)驗(yàn)組的生存率分別為33.3%、46.7%、66.7%，三組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0

6、5）；經(jīng)Kaplan-Meier分析，估計(jì)模型組、美能組、實(shí)驗(yàn)組的平均生存時(shí)間分別為64.6、71.9、83.9小時(shí),同時(shí)經(jīng)過(guò)log-rank檢驗(yàn)提示，實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組與美能組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而美能組與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。⑷療效指標(biāo)：肝功能：腹腔注射后36h，與空白組相比，模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平顯著升高，而ALB、CHE水平則顯

7、著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實(shí)驗(yàn)組ALT、AST、TBIL水平顯著降低，而ALB、CHE水平則顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；凝血功能：腹腔注射后36h，與空白組相比，模型組大鼠PT顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實(shí)驗(yàn)組的PT顯著縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③肝組織病理評(píng)分：腹腔注射后36h，各組大鼠肝組織均有不同程度的病理?yè)p害，其中模型

8、組最嚴(yán)重，經(jīng)美能或回陽(yáng)方治療后，病理?yè)p傷均有減輕，且以回陽(yáng)方組最佳。與模型組和美能組相比，實(shí)驗(yàn)組病理?yè)p害評(píng)分明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑸機(jī)制指標(biāo)：腹腔注射后36h，經(jīng)RT-PCR檢驗(yàn)，與空白組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實(shí)驗(yàn)組TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3水平顯著降低，差異均勻統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義（P<0.05）；腹腔注射后36h，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，與空白組相比，各組大鼠肝組織PCNA表達(dá)有所增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中以實(shí)驗(yàn)組為最佳，與模型組和美能組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)中，顯著升高的ALT、AST、TBIL水平，明顯延長(zhǎng)的PT，顯著降低的ALT、CHE水平，明顯增加的肝組織病理評(píng)分以及快速的死亡率均表明急性肝衰竭大鼠模型造模成功，且D-GalN最佳劑量為