清肝方對D-GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠肝損傷及肝再生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察清肝方對D-GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭熱毒血瘀證大鼠肝損傷及肝再生的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討清肝方抗ALF的作用環(huán)節(jié)及機(jī)理。
　　方法：
　　選取健康清潔級雌性SD大鼠125只，體重180±20g，隨機(jī)分為四組，即空白1、2組各10只，模型1、2組，美能1、2組及清肝方1、2組各20、15只。其中，1組用于造模后36h取血及肝組織標(biāo)本;2組用于觀察造模后96h大鼠的生存率。建模前12h禁食，除空白組外，其

2、余各組用D-GalN1.4g/kg單次腹腔注射建立大鼠ALF熱毒血瘀證模型;空白組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。造模前3天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每日灌胃1次，空白組和模型組給予蒸餾水10ml/kg/d灌胃，美能組給予成人等效臨床劑量15.6mg/kg/d，清肝方組給予成人等效臨床劑量29.7g/kg/d。動物自由飲食。以腹腔注射的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，造模36h后取1組大鼠，經(jīng)股動脈取血6ml，其中4ml置于干燥管中，另2ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中，常規(guī)分離

3、血清，-20℃凍存待測。斷頸處死動物后，沿腹正中線剖開皮膚，分離出肝組織，取肝左葉相同部位存放于10％中性福爾馬林液固定，并取肝右葉置于冰塊上，以PBS緩沖液清洗干凈后，切取1.0cm×1.0cm×0.2cm大小的肝組織1塊，置于凍存管中，迅速用液氮速凍后轉(zhuǎn)運(yùn)至-70℃冰箱備測。主要觀察96h內(nèi)各組大鼠的行為學(xué)變化及生存率;全自動生化分析法檢測血清ALT、AST、TBi1、ALB及CHE;全自動血凝分析法檢測血漿PT;SABC免疫組化法

4、檢測肝組織PCNA;RT-PCR熒光法檢側(cè)肝組織TLR4、NF-κB、HMGB1及caspase-3mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、96h生存率:①模型組生存率為33.3％，美能組為46.7％，清肝方組為66.7％，三組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②模型組、美能組及清肝方組估計(jì)平均生存時(shí)間分別為64.6、71.9、83.3h;log-rank檢驗(yàn)提示清肝方組累積生存率高于模型組(P＜0.05)，而美能組與模型

5、組、清肝方組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、肝功能及凝血功能:模型組與空白組、清肝方組相比，在血清ALT、AST、TBiL水平及血漿PT水平方面明顯升高，而在血清ALB、CHE水平方面顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。美能組僅在ALT、AST及TBiL水平方面與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、肝組織病理評分:模型組病理損害積分明顯高于空白組，而清肝方組及美能組的積分都低于模型組，

6、且清肝方對肝臟病理損害的改善更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、RT-RCR檢測指標(biāo)表達(dá)情況:空白組肝組織TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3mRNA表達(dá)水平較低，而在模型組中明顯表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。應(yīng)用美能或清肝方后，TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3的表達(dá)量均顯著下降，且清肝方組下降幅度大于美能組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、肝

7、組織PCNA表達(dá)情況:造模后PCNA在肝組織中的表達(dá)增加，而給予清肝方或美能灌胃可進(jìn)一步提高其表達(dá)水平，尤其是清肝方的作用明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、清肝方可顯著減輕D-GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭熱毒血瘀證大鼠肝細(xì)胞的損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，改善肝功能及肝臟病理，延長生存時(shí)間，降低死亡率。
　　2、清肝方抗D-GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠模型的可能機(jī)制:①通過下調(diào)肝組織TLR4表達(dá)，阻斷由

8、相關(guān)病原分子、LPS等激活的TLR4/NF-κB信號通路，減少前炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)，還可影響樹突狀細(xì)胞的成熟，抑制過亢的免疫反應(yīng)。②降低NF-κB在肝組織中的表達(dá)，可減少TNF-α、IL-1、IL-6等信號的過度激活，中斷炎癥的級聯(lián)反應(yīng)。③降低肝組織HMGB1表達(dá)水平，可阻斷HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路。④下調(diào)caspase-3的表達(dá)水平，可抑制肝細(xì)胞的凋亡，還可減少因中性粒細(xì)胞侵潤而繼發(fā)的肝細(xì)胞壞死。⑤上調(diào)肝組織PCNA