渥曼青霉素對LPS-D-GalN誘導急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的影響.pdf

1、目的:
　　眾所周知，腸道是人體最大的“儲菌所”，在人體腸道內(nèi)寄生著500-1000種共計100萬億個細菌（這些細菌影響著人的消化能力和免疫功能，對人體的健康非常重要）。其中的革蘭氏陰性菌死亡的時候會釋放內(nèi)毒素，因此腸道也是人體最大的“內(nèi)毒素庫”。由腸源性內(nèi)毒素引發(fā)的急性肝損傷是臨床上導致肝臟功能衰竭的常見原因之一。LPS作為內(nèi)毒素的主要成分，通過腹腔注射到小鼠體內(nèi)，能夠很好的模擬腸源性內(nèi)毒素發(fā)生感染的過程，而D-GalN能夠特異

2、性的消耗肝臟內(nèi)的UTP，從而抑制相應的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成，最終導致肝細胞的損傷甚至死亡。LPS與D-GalN的聯(lián)合注射能夠特異性的造成肝臟的暴發(fā)性衰竭，是研究急性肝損傷的很好的動物模型。
　　自噬是一種在所有真核細胞中都穩(wěn)定存在的，以一種雙分子膜包裹著細胞質(zhì)成分成為自噬體，隨后這些結(jié)構(gòu)和溶酶體融合，遞送的“貨物”被降解和回收的過程，是對發(fā)育、分化、生存以及穩(wěn)態(tài)起重要作用的胞內(nèi)途徑。在過去的十多年中，其在人類疾病中的作用被廣泛

3、關(guān)注。最近數(shù)據(jù)表明自噬參與多種肝臟疾病的發(fā)生。然而關(guān)于自噬在急性肝損傷中的作用的報道卻很少而且結(jié)果也不一致。
　　渥曼青霉素是一種自繩狀青霉中分離出來的抗真菌類抗生素，它沒有抗細菌能力，只特異性地作用于真菌。很多文獻報道渥曼青霉素能夠在體內(nèi)外抑制自噬。本課題的目的是擬探討LPS/D-GalN誘導急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的改變及采用渥曼青霉素預處理對LPS/D-GalN誘導急性肝損傷中肝組織壞死、凋亡及自噬的影響。通過本研

4、究的完成，不僅可以進一步闡明LPS/D-GalN誘導小鼠發(fā)生急性肝損傷的分子機制，還可以為開發(fā)臨床上治療腸源性內(nèi)毒素引發(fā)的急性肝損傷的藥物提供借鑒價值。
　　方法:
　　一、脂多糖/D-半乳糖胺誘導小鼠的急性肝損傷情況
　　利用脂多糖/D-半乳糖胺腹腔注射到野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立小鼠的急性肝損傷內(nèi)毒素誘導模型，在誘導3小時以及5小時后處死小鼠，收集血清、肝組織進行后續(xù)指標的測定。
　　1.利用醫(yī)用全自

5、動生化分析儀器對各小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平進行檢測。
　　2.采用蘇木素伊紅(HE)染色方法對肝組織切片進行病理學檢測，并利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定(TUNEL)檢測肝組織的凋亡情況。
　　3.采用免疫組織化學染色（immunohistochemistry，IHC）和免疫蛋白印跡(westernblot)方法檢測肝組織中caspase-3的活化水平。
　　二

6、、脂多糖/D-半乳糖胺誘導急性肝損傷過程中肝組織自噬水平的變化
　　1.采用免疫蛋白印跡方法檢測肝臟自噬標志物LC3B-Ⅱ的表達水平變化。
　　2.采用免疫組織熒光染色方法檢測肝臟中自噬小體形成的變化情況。
　　三、脂多糖/D-半乳糖胺誘導急性肝損傷過程中炎性細胞因子的分泌情況
　　1.利用BD公司開發(fā)的基于流式細胞儀的液相蛋白定量技術(shù)(BDTM CytometricBead Array(CBA) System)

7、對血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性細胞因子的含量進行檢測，另采用酶聯(lián)免疫吸附方法對血清中IL-1β的含量進行檢測。
　　2.采用RT-PCR方法對肝臟組織中以上各種炎性細胞因子(Tnfa、Mcp1、Il1β、Il6、Il10)的mRNA表達水平進行檢測。
　　四、渥曼青霉素預處理對小鼠急性肝損傷以及肝組織中炎性細胞因子分泌的影響
　　在注射脂多糖/D-半乳糖胺前1小時，將渥曼青霉素以同樣的方式注

8、射到小鼠體內(nèi)，然后再注射脂多糖/D-半乳糖胺誘導肝損傷，然后在誘導5小時后，處死小鼠，收集血清、肝組織再進行后續(xù)相關(guān)指標的測定。
　　1.測定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量，統(tǒng)計分析渥曼青霉素對小鼠肝臟功能的影響。
　　2.蘇木素伊紅染色檢測肝臟組織的病理學損傷，并同樣進行末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定，來探究渥曼青霉素對肝細胞壞死和凋亡的影響。
　　3.免疫組織化學染色和免疫蛋白印跡檢測分

9、析肝組織中caspase-3活化水平受渥曼青霉素的影響。
　　4.RT-PCR檢測肝臟中以上各種炎性細胞因子的mRNA水平變化，以明確渥曼青霉素對肝組織中炎性細胞因子分泌的影響。
　　五、渥曼青霉素預處理對肝組織自噬水平的影響
　　1.免疫蛋白印跡檢測自噬標志物LC3B-Ⅱ的表達變化，以探究渥曼青霉素對肝臟中自噬水平的影響。
　　2.免疫組織熒光染色檢測分析渥曼青霉素對肝臟中自噬小體形成的影響。
　　六、渥

10、曼青霉素預處理對肝組織中MAPK及NF-κB信號通路活化的影響
　　1.采用免疫蛋白印跡方法對肝臟內(nèi)MAPK通路中ERK、JNK、p38的活化情況即磷酸化水平進行檢測。
　　2.采用免疫蛋白印跡方法對肝臟內(nèi)NF-κB通路中p65的活化情況即磷酸化水平進行檢測。
　　結(jié)果:
　　一、脂多糖/D-半乳糖胺能誘導小鼠的急性肝損傷，造成肝組織的壞死和凋亡
　　1.小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，在被誘導肝損

11、傷3小時后并沒有變化，但在誘導5小時后明顯升高。
　　2.小鼠的肝組織，在被誘導損傷3小時后開始出現(xiàn)少量的炎性細胞浸潤和充血，而在誘導5小時后出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤并伴有嚴重的充血。
　　3.肝臟內(nèi)TUNEL陽性細胞，在被誘導損傷3小時后有少量出現(xiàn)，但在誘導5小時后明顯增多;另外caspase-3在被誘導3小時后沒有活化，但在誘導5小時后明顯活化。
　　二、在脂多糖/D-半乳糖胺導致小鼠急性肝損傷過程中肝組織中的自噬水

12、平升高
　　1.小鼠肝臟內(nèi)LC3B-Ⅱ的表達在被誘導損傷3小時后沒有變化，但在誘導5小時后明顯升高。
　　2.肝臟內(nèi)自噬小體在被誘導損傷3小時后就已經(jīng)開始形成，在誘導5小時后，形成明顯增多。
　　三、在脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷中炎性細胞因子分泌增加
　　1.小鼠血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性細胞因子的水平在被誘導肝損傷3小時以及5小時后均明顯升高。
　　2.小鼠肝臟

13、中Tnfa、Mcp1、Il1β、Il6、Il10等炎性細胞因子的mRNA表達水平在被誘導損傷3小時以及5小時后也均明顯增加。
　　四、渥曼青霉素預處理能夠減輕脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷過程中肝臟的損傷程度，抑制炎性細胞因子的分泌
　　1.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量明顯降低。
　　2.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠肝臟內(nèi)充血和炎性細

14、胞浸潤明顯減少，病理學損傷明顯改善。
　　3.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠肝臟內(nèi)凋亡細胞數(shù)量明顯減少，caspase-3的活化水平明顯降低。
　　4.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠肝臟內(nèi)除Mcp1之外的Tnfa、Il1β、Il6、Il10等炎性細胞因子的mRNA的水平明顯降低。
　　五、渥曼青霉素預處理能夠抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷過程中肝組織自噬水平的升高

15、>　　1.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠肝組織中自噬水平的升高明顯被抑制，回歸未誘導肝損傷之前的本底水平。
　　2.相比于渥曼青霉素未處理組，渥曼青霉素預處理組小鼠肝組織中自噬小體的形成也明顯減少。
　　六、預注射渥曼青霉素能夠抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷過程中肝組織內(nèi)MAPK和NF-κB通路的活化
　　1.相比于未預注射渥曼青霉素組，預注射渥曼青霉素組小鼠肝組織內(nèi)pJNK、p38活化

16、水平?jīng)]有變化，但pERK活化水平受到抑制。
　　2.相比于未預注射渥曼青霉素組，預注射渥曼青霉素組小鼠肝組織內(nèi)p65的活化水平受到抑制。
　　結(jié)論及意義:
　　以上實驗結(jié)果說明在脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠急性肝損傷過程中，脂多糖/D-半乳糖胺不僅能通過誘導Tnfa等炎性細胞因子的分泌導致肝組織的壞死和凋亡，還能導致自噬水平的升高。然而，渥曼青霉素預處理可抑制自噬，與此同時，渥曼青霉素還能降低炎性細胞因子的水平，減輕

17、肝組織的壞死和凋亡，并最終減輕肝臟的損傷程度。但因為渥漫青霉素并非自噬的特異性抑制劑，我們并不能確定是否是由于渥曼青霉素抑制了自噬從而使得肝組織壞死、凋亡以及肝損傷減輕的。
　　我們的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)了渥曼青霉素能夠在體內(nèi)有效的減輕脂多糖/D-半乳糖胺誘導的小鼠的急性肝損傷，這為臨床上研發(fā)治療腸源性內(nèi)毒素誘導的急性肝損傷的藥物提供了重要的借鑒意義;另外我們還發(fā)現(xiàn)自噬在該過程中有可能起著重要的作用，這對進一步探究腸源性內(nèi)毒素誘導的急