富勒烯衍生物調(diào)控腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞功能的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤作為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一，極大地危害著人類的健康。隨著腫瘤藥理學(xué)的發(fā)展，改善腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療策略。腫瘤微環(huán)境是腫瘤所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細胞、腫瘤局部浸潤的免疫細胞、間質(zhì)細胞及所分泌的活性介質(zhì)等共同構(gòu)成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。在實體腫瘤的微環(huán)境中，成纖維細胞是最豐富一類細胞。在腫瘤微環(huán)境中，成纖維細胞獲得一種活化表型，稱為激活的成纖維細胞（activatedfibroblasts）或癌

2、相關(guān)成纖維細胞（cancer-associatedfibroblasts，CAFs）。CAFs可以促進腫瘤的生長和擴散，通過其產(chǎn)生的多種生長因子以及趨化因子影響腫瘤細胞的各個方面。因此，成纖維細胞作為抗腫瘤治療的新靶點受到了越來越多的關(guān)注。
　　 富勒烯衍生物由于自身獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，近幾年來已被開發(fā)用于癌癥的診斷和治療，可用于光動力治療、光熱治療、放射治療及化療。但是，關(guān)于富勒烯衍生物的抗腫瘤研究大多針對于藥物對腫瘤細胞的直

3、接作用，而很少關(guān)注其對腫瘤微環(huán)境的影響。本文所用富勒烯衍生物為——富勒醇(C60(OH)22)及內(nèi)嵌金屬富勒醇(Gd@C82(OH)22，簡寫Gd@C82)。
　　 第一部分:富勒醇的合成
　　 目的:合成多羥基富勒烯衍生物——富勒醇，供后續(xù)實驗所用。
　　 方法:采用四丁基氫氧化銨(TBAH)催化堿法合成富勒醇，并使用SephadexG-25層析柱進行純化。利用透射電子顯微鏡對富勒醇形貌及粒徑大小進行表征。

4、r>　　 結(jié)果:以90mg的富勒烯為原料，最終得到富勒醇92mg，產(chǎn)率為67.27％。透射電鏡的表征結(jié)果顯示，超純水溶劑中富勒醇為粒徑100-200nm的球形納米顆粒。
　　 結(jié)論:采用TBAH催化堿法制備了富勒醇，產(chǎn)率較高，顆粒大小較均勻。
　　 第二部分:富勒烯衍生物對腫瘤微環(huán)境中CAFs增殖和分泌功能的影響及機制研究
　　 目的:研究富勒醇及Gd@C82對正常成纖維細胞HFL-1及CAFMCA205的影響

5、，并初步探討其作用機制。
　　 方法:
　　 1.不同濃度的富勒醇或Gd@C82培養(yǎng)MCA205和HFL-1細胞24h或72h，CCK-8法檢測各組細胞活力。
　　 2.用25μM的富勒醇或Gd@C82處理MCA205細胞24h，收集其培養(yǎng)上清濾除藥物后與正常培養(yǎng)基1∶1混合培養(yǎng)Lewis肺癌細胞，劃痕實驗檢測Lewis肺癌細胞遷移能力。
　　 3.用含25μM富勒醇或Gd@C82的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，24h

6、或72h后，收集各組培養(yǎng)上清，ELISA檢測其中TGF-β1、IL-6和VEGF的含量。
　　 4.免疫熒光法檢測富勒醇或Gd@C82處理MCA205細胞72h后，細胞內(nèi)TGF-β1表達情況。
　　 5.25μM的富勒醇或Gd@C82處理MCA205細胞24h或72h后，Westernblot檢測細胞內(nèi)TGF-β1蛋白的表達情況。
　　 6.25μM的富勒醇或Gd@C82處理MCA205細胞24h或72h后，Re

7、al-TimePCR檢測細胞內(nèi)TGF-β1mRNA的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.25μM的富勒醇或Gd@C82處理24h，對MCA205細胞的增殖均無顯著抑制作用。50μM的Gd@C82處理24h，能顯著抑制MCA205細胞的增殖。同時，25μM和50μM的富勒醇和Gd@C82對HFL-1細胞的增殖均無顯著影響。
　　 2.對照組Lewis肺癌細胞劃痕4h后開始遷移，而實驗組細胞遷移不明顯。
　　

8、 3.以25μM的富勒醇或Gd@C82處理24h或72h，HFL-1細胞各組培養(yǎng)上清中TGF-β1含量無顯著性差異。而MCA205細胞，實驗組培養(yǎng)上清中TGF-β1含量顯著低于對照組。同時富勒醇和Gd@C82能夠顯著降低MCA205細胞培養(yǎng)上清中IL-6及VEGF的含量。
　　 4.免疫熒光和Westernblot結(jié)果顯示，富勒醇和Gd@C82均能下調(diào)MCA205細胞內(nèi)TGF-β1蛋白的表達量，且該下調(diào)作用隨作用時間延長而增強。

9、
　　 5.Real-TimePCR結(jié)果顯示，富勒醇或Gd@C82處理后的MCA205細胞的TGF-β1mRNA表達水平較對照組降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.高濃度的Gd@C82能抑制MCA205細胞增殖，低濃度的富勒烯衍生物則無顯著影響。無論高濃度還是低濃度的富勒烯衍生物均對正常成纖維細胞HFL-1的增殖無顯著影響。
　　 2.富勒烯衍生物能抑制MCA205細胞分泌TGF-β1、IL-6及VEGF，從