定向固定化TEVp及其可視化酶切研究.pdf

1、煙草蝕斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)具有識(shí)別序列專一性高和酶切效率高的優(yōu)點(diǎn)，常用于融合蛋白標(biāo)簽去除。為了提高TEVp的使用效率，本研究中，構(gòu)建、表達(dá)和純化了TEVp和其它融合蛋白，其N端融合纖維素結(jié)合模塊(Cellulose-binding module，CBM)能將TEVp和4種彩虹蛋白固定于再生多空纖維素(Regenerated amorphous cellulose，RAC)，分析

2、了游離態(tài)和固定化TEVp的性質(zhì)，并可視化檢測(cè)固定化TEVp柱上酶切融合蛋白，獲得以下結(jié)果:
　　1.構(gòu)建融合蛋白酶及其酶切融合底物:構(gòu)建的TEVp的N端和C端分別含有CBM標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽，同法構(gòu)建失活突變體TEVpC151A的融合蛋白。選取4種彩虹蛋白即祖母綠綠色熒光蛋白(EmGFP)、櫻桃紅紅色熒光蛋白(mCherry)、含有Fe-S簇的棕色玉米西羅葉綠三酸鐵螯合酶(maize sirohydrochlorin ferroch

3、elatase，ZmSF)和紅色透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb），分別在其上游融合表達(dá)CBM，在標(biāo)簽和靶蛋白之間，加一個(gè)TEVp酶切序列，為提高切割效率，在CBM和VHb加兩個(gè)酶切序列。另外以GST融合的大腸桿菌二氨基丙酸氨解酶(E.coli diaminopropionate ammonia-lyase，eDAL)和玉米絲氨酸消旋酶(maize serine racemase，ZmSR)為TE

4、Vp的底物。
　　2.重組蛋白的表達(dá)和純化:所有融合蛋白均在大腸桿菌BL21(DE3)中融合表達(dá)，誘導(dǎo)條件是28℃，12h。收菌破碎后，Ni-NTA純化融合TEVp，分別利用RAC吸附融合TEVp及其酶切底物融合蛋白。
　　3.游離態(tài)和固定化TEVp的性質(zhì)分析:SDS-PAGE檢測(cè)表明，經(jīng)不同親和介質(zhì)純化的TEVp都含有一定的雜質(zhì)蛋白，每克RAC可吸附約220mgCBM-TEVp-H6。動(dòng)力學(xué)分析表明，固定化TEVp的催化常

5、數(shù)低于游離態(tài)蛋白酶。游離態(tài)TEVp在4℃保存10d后，酶活降低了約60％，而固定化TEVp經(jīng)相同條件貯存后酶活僅降低了約22％，約2.1％的融合TEVp從RAC解離。固定化TEVp重復(fù)使用5次之后酶活性依然能達(dá)到約初始酶活的40％。
　　4.不同條件下固定化TEVp柱上酶切融合EmGFP的效率分析:以含有CBM標(biāo)簽的EmGFP作為底物，探究固定化TEVp柱上酶切最適反應(yīng)條件。結(jié)果表明，融合底物與固定化蛋白酶以30∶1的濃度比例在3

6、5℃下反應(yīng)3小時(shí)酶切反應(yīng)已達(dá)到平穩(wěn)期。
　　5.可視化觀察固定化TEVp柱上酶切融合蛋白導(dǎo)致彩虹蛋白從RAC解離的效果。從RAC介質(zhì)顏色判斷，除EmGFP外，其余3種彩虹蛋白能有效從RAC解離，這種觀察結(jié)果進(jìn)一步得到SDS-PAGE分析驗(yàn)證。
　　綜上所述，本研究證明RAC能有效固定TEVp和其它含有CBM標(biāo)簽的融合蛋白，固定化提高了TEVp的穩(wěn)定性，并且固定化酶可重復(fù)使用，在一定程度上彌補(bǔ)了固定化后酶活性稍有降低的不足;柱