低劑量X射線(xiàn)誘導(dǎo)小鼠骨髓和人外周血紅細(xì)胞微核率流式儀自動(dòng)化檢測(cè)的研究.pdf

1、隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，射線(xiàn)、微波、電磁輻射等在人類(lèi)的生活越來(lái)越普及，例如醫(yī)療診斷、特殊造影、醫(yī)用治療以及商用輻照等。然而科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步也給人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)了許多負(fù)面影響，其中最重要的是人類(lèi)健康問(wèn)題。輻射線(xiàn)對(duì)人類(lèi)的健康造成了嚴(yán)重的威脅，許多人已經(jīng)注意到它對(duì)機(jī)體遺傳物質(zhì)的損傷。世界各國(guó)對(duì)射線(xiàn)、微波、電磁輻射等都有規(guī)范的，統(tǒng)一的評(píng)價(jià)程序，其中最常用的是染色體畸變(CA)分析和微核實(shí)驗(yàn)(MNT)。CA分析的優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)果精確，可靠，能夠提供的信息比較豐

2、富，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。傳統(tǒng)的微核實(shí)驗(yàn)(MNT)已滿(mǎn)足不了實(shí)際工作的需要，依然依賴(lài)于人工顯微鏡計(jì)數(shù)，主觀(guān)性太強(qiáng)；一般要求計(jì)數(shù)數(shù)干個(gè)細(xì)胞，工作量太大且敏感性較低，并能導(dǎo)致一些樣本的漏檢或出現(xiàn)一些假陽(yáng)性。發(fā)展微核的自動(dòng)化檢測(cè)就成為快速監(jiān)測(cè)人群遺傳損傷的重要手段。 近年來(lái)隨著流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)不斷的改進(jìn)與完善，國(guó)內(nèi)外很多專(zhuān)家、學(xué)者均致力于自動(dòng)化試驗(yàn)的研究。1992年瑞典科學(xué)家Grawe發(fā)展了一種流式儀小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核

3、自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)，1993年我室曹佳發(fā)展并改進(jìn)了這一技術(shù)，使其達(dá)到了實(shí)用化水平。2003年，我室孫立平建立基于單激光流式細(xì)胞儀的大鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的自動(dòng)化檢測(cè)體系；并結(jié)合磁式細(xì)胞分離技術(shù)，成功應(yīng)用于人鼻咽癌(NPC)放療患者外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核率的檢測(cè)，初步嘗試將該方法作為估算累積輻射劑量的生物計(jì)量?jī)x使用。 本研究是在我室前期工作基礎(chǔ)上，以小鼠為動(dòng)物模型，建立了低劑量X射線(xiàn)誘導(dǎo)小鼠骨髓紅細(xì)胞微核率流式細(xì)胞儀自動(dòng)化檢測(cè)方法。隨后

4、，利用該方法結(jié)合新近發(fā)展的磁式細(xì)胞分離技術(shù)，觀(guān)察頭面部癌癥患者接受低劑量X射線(xiàn)治療后外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核率的動(dòng)態(tài)變化。 研究所得主要結(jié)果如下： 1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)低劑量X射線(xiàn)輻照后小鼠骨髓fMNPCE與fMNNCE:經(jīng)過(guò)對(duì)不同的檢測(cè)參數(shù)的分析比較，最終確定以FL1(指示DNA熒光強(qiáng)度)為縱坐標(biāo)，F(xiàn)SC(指示細(xì)胞大小)為橫坐標(biāo)能夠很好地區(qū)分各個(gè)細(xì)胞群——總有核細(xì)胞(TNC)、嗜多染紅細(xì)胞(PCE)、含微核的嗜多染紅細(xì)胞(M

5、NPCE)、正染紅細(xì)胞(NCE)以及含微核的正染紅細(xì)胞(MNNCE)。經(jīng)X射線(xiàn)處理20小時(shí)后，一次輻照劑量0.05Gy、0.1Gy和0.4Gy，小鼠骨隨fMNPCE分別是3.01±0.55‰、4.58±±0.83‰和11.12±1.72‰；對(duì)于不同的累積劑量0.1Gy、0.15 Gy、0.2 Gy、0.3Gy、0.4Gy、0.8Gy、1.2Gy和1.6Gy，小鼠骨髓fMNPCE分別為4.72±0.95‰、10.26±2.09‰、13.7

6、7±1.66‰、11.77±2.33‰、17.71±2.19‰、16.43±1.33‰、21.85±3.25‰以及22.17±3.48‰；結(jié)果顯示出良好的劑量-反應(yīng)以及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果的比較：兩種方法檢測(cè)的結(jié)果均呈現(xiàn)良好的劑量-反應(yīng)以及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，但流式儀檢測(cè)結(jié)果略高于人工鏡檢結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析顯示兩種方法檢測(cè)的結(jié)果之間沒(méi)有顯著差異，并且二者之間具有良好的相關(guān)性(R=0.984，P<0.01

7、)。 3、磁式細(xì)胞分選術(shù)分離富集效果：共對(duì)7例健康志愿者及7例頭面部癌癥患者在接受不同累積放療劑量后的外周血中的CD71抗原陽(yáng)性的網(wǎng)織紅細(xì)胞(Trf-Ret)進(jìn)行了富集分離，結(jié)果表明，不同個(gè)體間Trf-Ret的產(chǎn)量差異很大，在20％-90％之間，但這并非分離方法所致，而是個(gè)體差異造成，如年齡，工作以及接受輻射線(xiàn)劑量大小等。并證實(shí)該方法具有簡(jiǎn)單、可靠，重復(fù)性好的特點(diǎn)。 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)低劑量X射線(xiàn)輻照后人外周血MN-Tr

8、f-Ret:以FL4(指示RNA熒光)為縱坐標(biāo)，F(xiàn)SC(指示細(xì)胞大小)為橫坐標(biāo)，將富集后人外周血樣本分成明顯的5個(gè)細(xì)胞群——網(wǎng)織紅細(xì)胞、含微核的網(wǎng)織紅細(xì)胞、成熟紅細(xì)胞、含微核的成熟紅細(xì)胞和有核細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀成功檢測(cè)了頭面部癌癥患者接受低劑量X射線(xiàn)輻照前后外周血MN-Trf-Ret的變化。結(jié)果顯示，頭面部癌癥患者接受放療后fMN-Trf-Ret快速顯著增高，隨著累積放療劑量的繼續(xù)增加，fMN-Trf-Ret一直處于高平臺(tái)水平。對(duì)應(yīng)于

9、不同的累積放療劑量0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy以及10Gy，fMN-Trf-Ret的平均值分別為2，89±0.93‰、16.2±2.31‰、23.84±3.22‰、32.17±6.95‰、30.89±9.35‰以及35.74±9.95‰。 5、低劑量X射線(xiàn)輻照的曲線(xiàn)擬合方程：在已獲得的fMN-Trf-Ret與累計(jì)放療劑量的量效以及時(shí)效反應(yīng)關(guān)系基礎(chǔ)上，經(jīng)SPSS13.0擬合的最佳曲線(xiàn)方程為Y=2.595+8.874x-1

10、.005x2+0.044X3(R=0.978，P<0.05)，初步研究認(rèn)為在0Gy-10Gy劑量范圍內(nèi)，可嘗試?yán)迷摲匠虒?duì)輻射事故中的輻射傷員的受照生物劑量進(jìn)行評(píng)估和進(jìn)一步驗(yàn)證。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了小鼠在低劑量X射線(xiàn)全身輻照后，觀(guān)察到骨髓紅細(xì)胞微核率的變化趨勢(shì)；并將其用來(lái)觀(guān)察人在接受低劑量X射線(xiàn)輻照前后外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核率變化情況。結(jié)果表明流式細(xì)胞儀自動(dòng)化檢測(cè)法在低劑量X射線(xiàn)具有敏感、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為