重組人NT-proBNP雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)試劑盒的研發(fā).pdf

1、隨著基因工程技術(shù)的成熟，運(yùn)用基因工程方法制備重組蛋白代替天然提取物并篩選抗體以滿足免疫學(xué)體外診斷原料需求，在診斷試劑領(lǐng)域得到了大力推廣[1];大部分重組蛋白具有與天然蛋白性質(zhì)相同的氨基酸組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)、相似的抗原表位及活性中心，故可作為天然活性蛋白的替代品進(jìn)行免疫獲得特異性抗體。
　　 B型腦鈉肽(BNP)具有控制水鹽平衡、維持壓力恒定、調(diào)節(jié)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用，主要受到壓力和容量?jī)煞N因素調(diào)節(jié)，進(jìn)而能預(yù)示出心室容積擴(kuò)大、左室舒張末期壓

2、增大，心室超負(fù)荷以及心臟損傷程度等一系列心血管異常情況。氨基末端B型腦鈉肽前體(N-terminal fragment of brain natriuretic peptideprohormone，NT-proBNP)是B型腦鈉肽前體(proBNP)形成BNP過(guò)程中產(chǎn)生的附屬產(chǎn)物，從生物學(xué)意義方面分析，是一種無(wú)活性蛋白，因與BNP等摩爾數(shù)生成，故NT-proBNP與BNP同樣可以作為一種心臟標(biāo)志物[2]。由于NT-proBNP缺乏主動(dòng)清

3、除機(jī)制，在體液中的半衰期要長(zhǎng)，濃度更大，更容易檢測(cè)，并且檢測(cè)樣本更容易獲得，因此其已經(jīng)成為一種主要的心臟檢測(cè)指標(biāo)，自問(wèn)世起則被稱為“劃時(shí)代的心衰標(biāo)志物”。NT-proBNP檢測(cè)試劑盒的研發(fā)不僅具有很高的科研價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值、還能推進(jìn)診斷試劑國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程、打破國(guó)外壟斷現(xiàn)象。
　　 重組NT-proBNP蛋白采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選大腸桿菌偏好密碼子，選擇融合蛋白標(biāo)簽重組表達(dá)增加蛋白穩(wěn)定性，發(fā)酵條件優(yōu)化后得到了較高的表達(dá)量[3]。兩步

4、親和層析純化目的蛋白，采用腸激酶酶切，將標(biāo)簽蛋白與目的蛋白分離并進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE及羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)顯示，純度達(dá)到95％以上，具有較高的生物學(xué)活性。
　　 經(jīng)檢測(cè)成功的重組蛋白具有天然蛋白相同的氨基酸序列及生物學(xué)活性，可用于免疫，制備單克隆抗體，經(jīng)過(guò)免疫、融合、檢測(cè)、篩選、克隆化、定株等過(guò)程，共獲得47株單克隆抗體，其中包含兩兩配對(duì)抗體8株，配對(duì)抗體靈敏度均小于4ng(p≤0.05)，親和力達(dá)到106以上(p