層層自組裝肝素-膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體促進(jìn)小口徑ePTFE人工血管內(nèi)皮化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備
　　目的：研究層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備過(guò)程及表面修飾涂層的穩(wěn)定性，探討制備優(yōu)良涂層效果的可行性。
　　方法：采用層層靜電組裝的方法將帶負(fù)電荷的肝素與帶正電荷的膠原交替涂覆到小口徑ePTFE人工血管上，隨后在其表面接枝CD133抗體，制備成功能性人工血管。采用掃描電鏡，紅外光譜儀評(píng)價(jià)制備過(guò)程

2、中涂層的變化，激光共聚焦顯微鏡觀察CD133抗體在涂層表面的接枝情況，接觸角測(cè)試儀檢測(cè)ePTFE血管材料表面修飾后親水性的改變。使用脫色搖床將肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體的ePTFE人工血管材料置入PBS溶液中洗滌2h，6h，12h，24 h，48h，采用激光共聚焦顯微鏡觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ePTFE人工血管材料表面CD133抗體熒光強(qiáng)度變化。
　　結(jié)果：掃描電鏡觀察結(jié)果示經(jīng)過(guò)肝素/膠原溶液反復(fù)處理后的ePTFE血管材料表面可見(jiàn)

3、一層膜狀物，即肝素/膠原復(fù)合電解質(zhì)膜;紅外光譜儀探測(cè)曲線的改變及肝素膠原特征性波峰的出現(xiàn)提示經(jīng)過(guò)肝素/膠原溶液反復(fù)交替處理后，涂層的厚度在增加;激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示ePTFE血管材料表面有較強(qiáng)的PE標(biāo)記的紅色熒光信號(hào)，證實(shí)了ePTFE復(fù)合涂層血管材料表面CD133抗體接枝成功。ePTFE血管材料經(jīng)過(guò)表面涂層修飾后接觸角測(cè)試結(jié)果顯示由127.24度降至106.86度，提示涂層修飾后的血管親水性增加。肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133

4、抗體的ePTFE人工血管材料經(jīng)過(guò)PBS溶液洗滌2h，6h，12h，24 h，48 h，后，激光共聚焦顯微鏡仍然可以觀察到較強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)，提示ePTFE人工血管材料表面涂層穩(wěn)定，CD133抗體接枝效果良好。
　　結(jié)論：層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的制備過(guò)程是可行的，且功能性涂層效果良好。
　　第二部分層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管的體外實(shí)驗(yàn)研

5、究
　　目的：研究層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管材料的抗凝血性能，血液相容性及生物相容性。
　　方法：采用層層靜電自組裝的方法將帶負(fù)電荷的肝素與帶正電荷的膠原交替涂覆到小口徑ePTFE人工血管材料上，隨后在其表面接枝CD133抗體，制備成復(fù)合涂層人工血管。參照ISO10993及GB/T16886標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法行血小板粘附實(shí)驗(yàn)，溶血實(shí)驗(yàn)，血漿復(fù)鈣時(shí)間實(shí)驗(yàn)和APTT、PT、TT測(cè)試，評(píng)

6、價(jià)復(fù)合涂層人工血管的血液相容性，同時(shí)對(duì)表面復(fù)合涂層修飾后的血管材料行大白鼠短期皮下植入實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，CCK-8和LDH釋放實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)復(fù)合涂層修飾人工血管的生物相容性。
　　結(jié)果：掃描電鏡檢測(cè)觀察到底物ePTFE人工血管材料表面有大量血小板黏附，血小板呈扁平狀貼覆在材料表面，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料表面有少量血小板貼覆(p＜0.05);肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體

7、的ePTFE血管材料及底物ePTFE血管材料的溶血率分別為1.56％，0.71％和2.41％，均小于5％，符合材料溶血性要求;底物ePTFE血管材料的血漿復(fù)鈣時(shí)間為510±137.5 s，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料觀察至30 min未見(jiàn)纖維蛋白絲。肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE血管材料的APTT、PT、TT較底物ePTFE血管材料有了較大幅度提高。大白鼠短期皮下植入

8、實(shí)驗(yàn)提示表面復(fù)合涂層修飾后的ePTFE人工血管材料周圍組織炎癥反應(yīng)較未處理的ePTFE人工血管稍輕，但無(wú)明顯差異。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)肝素膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體或未接枝抗體的ePTFE人工血管材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不影響細(xì)胞的粘附性。CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)中所使用的涂層制備材料肝素、膠原及CD133抗體對(duì)細(xì)胞的增殖活力無(wú)顯著影響且無(wú)毒性，生物相容性良好。
　　結(jié)論：層層自組裝肝素/膠原復(fù)合涂層接

9、枝CD133抗體小口徑ePTFE人工血管材料具有良好抗凝血性能，血液相容性及生物相容性。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)豬頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈小口徑人工血管移植模型的比較
　　目的：比較實(shí)驗(yàn)豬頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈小口徑人工血管移植模型的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　方法：12只健康實(shí)驗(yàn)豬，共進(jìn)行頸動(dòng)脈小口徑人工血管移植12次，股動(dòng)脈小口徑人工血管移植4次。從頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈血管的解剖，術(shù)中血管吻合操作的難易以及模型是否有利于評(píng)價(jià)術(shù)后移植血管通暢等發(fā)面比較頸動(dòng)脈及

10、股動(dòng)脈人工血管移植模型的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　結(jié)果：從血管解剖角度講，頸動(dòng)脈位置較深，吻合操作較困難，但血管管徑較粗，且分支少。股動(dòng)脈較頸動(dòng)脈位置表淺，更容易定位分離，術(shù)中操作易于暴露，吻合較為容易，但血管穿支血管較多，容易損傷出血。頸動(dòng)脈和股動(dòng)脈小口徑人工血管移植模型中，當(dāng)人工血管發(fā)生血栓形成時(shí)，實(shí)驗(yàn)豬術(shù)后均未能觀察到異常臨床表現(xiàn)，術(shù)后臨床觀察不能幫助準(zhǔn)確判斷移植血管通暢與否。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)豬頸動(dòng)脈及股動(dòng)脈人工血管移植模型的建立

11、均具有可行性，但二者各有利弊，均可以作為研究小口徑人工血管的動(dòng)物模型。
　　第四部分肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體促進(jìn)6mm口徑ePTFE人工血管內(nèi)皮化的研究
　　目的：諸多研究表明早期快速內(nèi)皮化可以一定程度上提高移植人工血管的通暢率。本節(jié)研究肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體是否可以促進(jìn)6mm口徑ePTFE人工血管快速內(nèi)皮化。
　　方法：采用的動(dòng)物模型包括豬頸動(dòng)脈血管移植模型及股動(dòng)脈血管移植模型兩種。納入本組

12、研究的健康實(shí)驗(yàn)豬4只，共進(jìn)行血管移植模型建立8次。植入的底物ePTFE血管2根，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體的ePTFE人工血管3根，接枝CD34抗體的ePTFE人工血管3根。采用血管彩超或CTA檢測(cè)移植血管的通惕情況及近心端和遠(yuǎn)心端吻合口形態(tài)，直徑及流速?；谟?jì)算機(jī)的流體力學(xué)分析軟件體外模擬移植血管的局部血流動(dòng)力學(xué)情況，分析6 mm口徑ePTFE人工血管局部血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。手術(shù)后飼養(yǎng)7天，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察，

13、掃描電鏡觀察植入的人工血管表面形態(tài)，同期進(jìn)行組織病理學(xué)分析及vWF免疫組化染色，觀察移植血管表面有無(wú)內(nèi)皮形成。
　　結(jié)果：移植的6mm口徑ePTFE人工血管通暢率達(dá)100％。術(shù)后即刻血管彩超及CTA檢查提示血管吻合口形態(tài)良好，無(wú)明顯狹窄?；谟?jì)算機(jī)的流體力學(xué)分析結(jié)果提示6姍口徑ePTFE人工血管對(duì)局部血流動(dòng)力學(xué)影響較小，移植血管局部壓力、切應(yīng)力、血流流線良好。大體標(biāo)本觀察示肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體和接枝CD34抗體的e

14、PTFE人工血管腔面較為光亮，裸ePTFE人工血管較為粗糙，少量附壁血栓形成。組織病理學(xué)分析示接枝CD133抗體和接枝CD34抗體的修飾的血管表面較裸血管表面有膜狀物形成，vWF染色結(jié)果顯示陽(yáng)性明顯。掃描電鏡結(jié)果提示接枝CD133抗體的血管表面較多內(nèi)皮細(xì)胞附著，接枝CD34抗體的血管次之，底物血管材料表面最少。
　　結(jié)論：肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體進(jìn)行表面修飾ePTFE人工血管可以促進(jìn)人工血管快速內(nèi)皮化，其抗血栓形成能力

15、尚需進(jìn)一步評(píng)估。
　　第五部分肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體4mm小口徑ePTFE人工血管血栓形成的原因分析
　　目的：直徑4mm的小口徑ePTFE人工血管由于容易發(fā)生血栓形成而導(dǎo)致移植血管堵塞，迄今為止尚未得到有效解決。該部分?jǐn)M對(duì)4 mm小口徑ePTFE人工血管發(fā)生血栓形成的原因作一分析。
　　方法：采用的動(dòng)物模型包括實(shí)驗(yàn)豬頸動(dòng)脈血管移植模型及股動(dòng)脈血管移植模型。本組研究采用實(shí)驗(yàn)豬12只，共進(jìn)行血管移植16次（

16、頸動(dòng)脈血管移植12次，股動(dòng)脈血管移植4次），植入肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD133抗體ePTFE人工血管6根，肝素/膠原復(fù)合涂層ePTFE人工血管4根，底物ePTFE人工血管3根，肝素/膠原復(fù)合涂層接枝CD34抗體ePTFE人工血管3根。術(shù)后采用血管彩超對(duì)移植血管近心端及遠(yuǎn)心端吻合口形態(tài)，吻合口直徑和吻合口流速進(jìn)行檢測(cè)，采用CTA對(duì)實(shí)驗(yàn)豬主動(dòng)脈弓及弓上血管重建，觀察植入血管的整體形態(tài)。采用CAST-Ⅰ型體外血栓模擬儀和血液粘度計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)豬的

17、血液理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)?；谟?jì)算機(jī)流體力學(xué)分析軟件模擬移植血管的局部血流動(dòng)力學(xué)情況，分析局部血流動(dòng)力學(xué)改變?cè)谛】趶絜PTFE人工血管血栓形成中的意義。術(shù)后飼養(yǎng)7天，對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行取材，觀察植入人工血管的大體形態(tài)，同時(shí)對(duì)人工血管進(jìn)行組織病理學(xué)分析及vWF免疫組化染色，觀察移植的人工血管表面有無(wú)內(nèi)皮形成。
　　結(jié)果：移植的小口徑ePTFE人工血管整體血栓堵塞率高達(dá)87.5％。CAST-Ⅰ體外血栓模擬儀和血液粘度計(jì)檢測(cè)結(jié)果提示納入研究的實(shí)驗(yàn)

18、豬不存在容易導(dǎo)致血栓形成的血液方面的異常因素?；谟?jì)算機(jī)流體力學(xué)分析結(jié)果提示ePTFE人工血管自身彈性較差，不能隨血液壓力變化發(fā)生容受性擴(kuò)張，植入的人工血管形成較明顯的縮窄管，可以導(dǎo)致近心端及遠(yuǎn)心端吻合口附近血液流體力學(xué)紊亂。大體標(biāo)本觀察示發(fā)生血栓形成的標(biāo)本，吻合口近心端及遠(yuǎn)心端均有血栓形成，血管仍然通暢的標(biāo)本表面亦有少量附壁血栓形成。組織病理學(xué)分析及vWF染色結(jié)果顯示三組人工血管表面均有不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，提示發(fā)生血栓形成前ePT