丘腦底核電刺激對猴偏側(cè)帕金森病紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)的影響.pdf

1、丘腦底核(STN)電刺激(DBS)目前已成為治療中晚期帕金森病(PD)的一項(xiàng)安全有效的治療方法。但是關(guān)于STNDBS的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過對猴偏側(cè)PD模型STN的長期慢性高頻電刺激，觀察紋狀體區(qū)細(xì)胞外液多巴胺及其代謝產(chǎn)物和氨基酸的變化。結(jié)果提示慢性STN高頻電刺激可以增加猴偏側(cè)PD模型刺激側(cè)紋狀體多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)和牛磺酸(Tau)的含量。 丘腦底核電刺激對猴偏側(cè)帕金森病紋狀體神經(jīng)遞

2、質(zhì)的影響y帕金森病(PD)是一種慢性退行性運(yùn)動系統(tǒng)疾病，其主要的病理變化為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性，紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)大量減少。丘腦底核(STN)電刺激(DBS)對于中晚期帕金森病有良好的療效，延長了運(yùn)動障礙緩解期，手術(shù)安全性高，術(shù)后并發(fā)癥較少，并且一部分病人術(shù)后可逐漸減少口服左旋多巴類藥物的劑量。但STNDBS仍是一項(xiàng)有待于探索的領(lǐng)域，許多問題仍待解決，包括一些基本理論如作用機(jī)理、長期療效的評定以及臨床適應(yīng)征等。 PD

3、的病理學(xué)改變主要是黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA的減少伴有基底節(jié)神經(jīng)核團(tuán)的功能改變。多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)在PD的病程及治療中起到了重要的作用。目前有研究表明，刺激大鼠PD模型的STN，可以增加紋狀體區(qū)DA的釋放和代謝。但是也有學(xué)者通過對臨床病例的研究后提出，STNDBS治療后并不能增加紋狀體區(qū)DA的釋放。因?yàn)?-羥基多巴(6-OHDA)制備的大鼠PD模型和人PD差別較大，并且動物試驗(yàn)研究所用的高頻電刺激均為短期結(jié)果，臨床病例研究有很多方面受到了限制。因此

4、，本研究采用目前與人類PD最接近的MPTP靈長類動物模型，對猴偏側(cè)PD模型STN長期慢性高頻電刺激，應(yīng)用在體微透析技術(shù)觀察紋狀體細(xì)胞外液DA及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)以及谷氨酸(glutamate，Glu)、?；撬?taurine，Tau)和γ-氨基丁酸(GABA)的變化，以確定STNDBS治療后紋狀體多巴胺和氨基酸的變化，對STN電刺激的作用機(jī)理和可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制作出合理的分析，為提高臨床治療

5、帕金森病療效，并為探索有效的延緩或阻止帕金森病病程的方法提供理論基礎(chǔ)。 第一部分：猴偏側(cè)帕金森病模型的制作目的：采用血管內(nèi)介入方法頸內(nèi)動脈注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)制備偏側(cè)猴PD模型，為STN-DBS提供帕金森病靈長類動物模型。 材料和方法：老年健康恒河猴3只，年齡均在10歲齡以上，體重8.5～10.0Kg。采用血管內(nèi)介入方法頸內(nèi)動脈注入MPTP制作恒河猴PD模型。全麻后在數(shù)字減影血管造影

6、(DSA)下，Seldinger法股動脈穿刺，置5F鞘，4F單彎造影管超選頸內(nèi)動脈造影，確認(rèn)造影管置入頸內(nèi)動脈后，緩慢注入MPTP生理鹽水溶液(0.2mg/ml，共50ml)。術(shù)后進(jìn)行行為學(xué)觀察和評估。MRI影像學(xué)檢查觀察注藥側(cè)黑質(zhì)及紋狀體區(qū)域信號變化。 結(jié)果：制備偏側(cè)PD模型后，行為學(xué)觀察均發(fā)現(xiàn)猴自主運(yùn)動明顯減少，注藥對側(cè)肢體肌張力增高，部分猴伴有靜止性震顫，運(yùn)動遲緩，向患側(cè)趴伏，步態(tài)不穩(wěn)，運(yùn)動障礙評分1個月后穩(wěn)定在6分以上。

7、阿樸嗎啡(apomorphine，APO)試驗(yàn)可誘發(fā)出向健側(cè)的快速旋轉(zhuǎn)(大于7圈/分)。MRI檢查顯示注藥側(cè)紋狀體區(qū)域信號較對側(cè)稍減低，未觀察到注藥側(cè)黑質(zhì)區(qū)域的信號改變。 結(jié)論：應(yīng)用血管內(nèi)介入方法頸內(nèi)動脈注射MPTP能夠成功建立猴偏側(cè)PD模型，行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)猴出現(xiàn)了典型的偏側(cè)帕金森病癥狀，阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)陽性。MRI證實(shí)在猴注藥側(cè)紋狀體區(qū)有PD的特征性改變，為進(jìn)一步STNDBS研究提供了有用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｑ軆?nèi)介入手術(shù)方法制作

8、偏側(cè)帕金森病模型耗時短，用藥劑量少，可控性好，創(chuàng)傷小，更適合老年猴PD動物模型的建立。 第二部分：猴偏側(cè)帕金森病紋狀體微透析研究目的：探討猴偏側(cè)帕金森病模型紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)的變化。 材料和方法：偏側(cè)帕金森病模型猴3只，其中雄性2只，雌性1只，年齡均在10歲齡以上，體重在8.5～10.0Kg。另外選擇健康正常獼猴2只，年齡均在10歲齡以上體重分別為8.5kg和9.5kg，雄性雌性各1只。雙側(cè)殼核和尾狀核植入微透析導(dǎo)針。并同時

9、植入DBS電極和脈沖發(fā)生器。采用微透析結(jié)合高效液相色譜系統(tǒng)檢測2只模型猴和2只正常猴子的雙側(cè)紋狀體細(xì)胞外液DA、DOPAC、HVA、Glu、GABA和Tau的含量。將另外1只猴處死分別取兩側(cè)尾狀核、殼核和黑質(zhì)組織，行病理切片，HE和酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，TH)免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡檢查，并沿導(dǎo)針和電極方向切開腦組織確定微透析導(dǎo)針和電極的位置。 結(jié)果：模型制備成功后運(yùn)動障礙評分1個月后穩(wěn)定在6分

10、以上。MPTP側(cè)尾狀核的DA、DOPAC和HVA含量分別比對側(cè)尾狀核降低60.8％、100％和87.2％；MPTP側(cè)殼核的DA、DOPAC和HVA含量分別比對側(cè)殼核降低57.3％、100％和73.1％。偏側(cè)PD模型獼猴MPTP側(cè)尾狀核細(xì)胞外液Glu、Tau和GABA的含量高于對側(cè)尾狀核，分別為對側(cè)的2.2倍、3.0倍和2.5倍(p＜0.05)。MPTP側(cè)殼核細(xì)胞外液Glu、Tau和GABA的含量高于正常殼核，其中GABA顯著升高(p＜0

11、.05)，Glu、Tau也升高，但無顯著性差異(p＞0.05)。偏側(cè)PD模型獼猴MPTP側(cè)殼核細(xì)胞外液Glu、Tau和GABA的含量低于MPTP對側(cè)殼核細(xì)胞外液Glu、Tau和GABA的含量，分別是對側(cè)殼核的32.0％、37.7％、和32.6％(p＜0.05)。病理切片經(jīng)HE染色和TH免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)注藥側(cè)黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞變性減少，紋狀體區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目也減少，殘留神經(jīng)元變性。黑質(zhì)紋狀體區(qū)TH陽性多巴胺神經(jīng)元較正常側(cè)減少85％以

12、上。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)線粒體腫脹、嵴消失，髓鞘節(jié)段性溶解和松散，脂核素增多，膠質(zhì)細(xì)胞增生。微透析導(dǎo)針和電極位置正確。 結(jié)論：模型猴MPTP注射側(cè)紋狀體細(xì)胞外液的多巴胺及其代謝產(chǎn)物降低，Glu、Tau和GABA的含量升高。這提示MPTTP側(cè)紋狀體細(xì)胞外液的多巴胺及其代謝產(chǎn)物和Glu、Tau、GABA發(fā)生了一系列變化。 第三部分：丘腦底核電刺激對猴偏側(cè)帕金森病紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)的影響目的：應(yīng)用微透析技術(shù)探討慢性STN-DBS對紋狀體細(xì)

13、胞外液多巴胺及氨基酸的影響。 方法：選擇已經(jīng)成功安裝腦深部刺激電極的偏側(cè)PD獼猴模型2只，分別在打開脈沖發(fā)生器前和打開脈沖發(fā)生器的不同時間點(diǎn)取樣。應(yīng)用高效液相-電化學(xué)方法(HPLC-ECD)檢測開機(jī)前后的尾狀核和殼核細(xì)胞外液的多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量(開機(jī)前和開機(jī)后8小時、1周、1個月、兩個月)，應(yīng)用高效液相色譜—熒光檢測法(HPLC-FD)檢測開機(jī)前后Glu、GlY、Tau和GABA含量(開機(jī)前和開機(jī)后2小時、6-8小時、1周、

14、1個月)。 結(jié)果：電極側(cè)殼核和尾狀核的DA在開機(jī)后8小時、1周、1個月、2個月相應(yīng)地分別較各自開機(jī)前的DA含量增高了39％、91％、111％、114％和31％、91％、106％、102％(p＜0.05)。電極側(cè)殼核和尾狀核HVA/DA在開機(jī)后8小時分別較各自開機(jī)前增高了186％和91％(p＜0.05)，而開機(jī)后1周、1個月、2個月HVA/DA較開機(jī)前無明顯變化(p＞0.05)。電極側(cè)尾狀核的Glu在開機(jī)后的各個時間點(diǎn)均高于開機(jī)前

15、，開機(jī)后1周和1個月的升高和開機(jī)前相比有顯著性差異(p＜0.05)，而開機(jī)2小時和8小時的升高和開機(jī)前相比無顯著性差異(p＞0.05)。電極側(cè)尾狀核的GABA在開機(jī)后的各個時間點(diǎn)均高于開機(jī)前但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異(p＞0.05)。電極側(cè)尾狀核的Tau在開機(jī)后各個時間均高于開機(jī)前，而在開機(jī)后1周和1個月時非常顯著的高于開機(jī)前(p＜0.01)。電極側(cè)殼核的Glu、GABA和Tau含量在開機(jī)后的各個時間點(diǎn)均高于開機(jī)前，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理開機(jī)后1