豬5個(gè)NADH呼吸鏈相關(guān)基因和SMTN基因的分離、定位、時(shí)空表達(dá)和關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、豬作為目前世界上飼養(yǎng)最廣泛的肉用家畜,其產(chǎn)肉性能一直是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究室在利用LongSAGE技術(shù)對(duì)不同品種和不同發(fā)育階段的豬胚胎骨骼肌進(jìn)行全基因組轉(zhuǎn)錄譜研究的過(guò)程中得到6個(gè)差異表達(dá)基因,其中5個(gè)基因均與線粒體NADH呼吸鏈的功能有關(guān)。骨骼肌是一種代謝旺盛的器官,其肌纖維中含有豐富的線粒體,而線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生能量的主要部位,與線粒體功能相關(guān)的基因必然與肌肉的生長(zhǎng)和品質(zhì)有關(guān)。但是,目前對(duì)線粒體相關(guān)基因的研究集中于大腸桿菌、牛和

2、人,在豬上還沒(méi)有進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。因此,本研究選擇NADH呼吸鏈相關(guān)基因,以及與人類(lèi)心血管疾病相關(guān)的.SMTN基因,以豬的骨骼肌為研究對(duì)象,用人×倉(cāng)鼠體細(xì)胞雜種克隆板進(jìn)行6個(gè)基因的染色體定位、CDS克隆和序列分析、用半定量RT-PCR進(jìn)行時(shí)空表達(dá)譜分析、進(jìn)行突變位點(diǎn)的篩選、并利用3個(gè)豬群的產(chǎn)肉性狀資料進(jìn)行基因型與性狀的關(guān)聯(lián)分析,以期初步了解這些基因的結(jié)構(gòu)和功能,并為改進(jìn)豬產(chǎn)肉性能的標(biāo)記輔助選擇提供資料。同時(shí),利用3種小型豬群體的資料進(jìn)

3、行的性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可為其已經(jīng)作為研究人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型增添寶貴的種質(zhì)特性與遺傳學(xué)資料。
　　 本研究的結(jié)果如下:
　　 1.利用豬的EST信息分離了豬骨骼肌中差異表達(dá)的6個(gè)新基因,它們分別為NDUFAB1、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS5、NDUFS7和SMTN,獲得了基因的基因組DNA片段,并對(duì)其序列進(jìn)行了分析；
　　 2.用豬×倉(cāng)鼠體細(xì)胞輻射雜種板(IMpRH),對(duì)6個(gè)新基因進(jìn)行了染色定位,分別將N

4、DUFAB1基因定位于SSC3p,與標(biāo)記S0174連鎖,LOD值10.46；NDUFS2基因定位于SSC4q,與標(biāo)記SW589連鎖,LOD值8.52；NDUFS3定位于SSC2p,與標(biāo)記SW1450連鎖,LOD值13.46；NDUFS5定位于SSC6q,與標(biāo)記SW1473連鎖,LOD值11.14;NDUFS7定位于SSC2q21-q24,與標(biāo)記SW395連鎖,LOD值7.43；SMTN基因定位于SSC14q21-q22,與標(biāo)記SW261

5、2連鎖,LOD值12.56。并與人的相應(yīng)基因定位結(jié)果進(jìn)行了符合性比較。
　　 3.用豬的EST信息設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增,獲得了6個(gè)基因的CDS,根據(jù)CDS序列對(duì)基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè),并對(duì)豬、人、牛和小鼠的相應(yīng)基因進(jìn)行了物種間進(jìn)化樹(shù)分析。NDUFAB1的CDS長(zhǎng)471 bp,NDUFS2的CDS長(zhǎng)1392 bp,NDUFS3的CDS長(zhǎng)795 bp,NDUFS5的CDS長(zhǎng)321 bp,NDUFS7的CDS長(zhǎng)648 bp,SMT

6、N的CDS長(zhǎng)2475 bp。
　　 4.利用半定量RT-PCR技術(shù)研究了6個(gè)新基因在豬的骨骼肌、心、肝、腦、脾、淋巴結(jié)、肺、腎、大腸、小腸和脂肪等11種組織中的表達(dá)情況,以及在33 d、65 d、90 d胚胎和成年豬骨骼肌中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)5個(gè)NADH相關(guān)基因在心、肝、腦、腎中的表達(dá)量都很高,而在骨骼肌中的表達(dá)量都較低。SMTN基因在脾中的表達(dá)量很高,而在骨骼肌、心、腦、腎中的表達(dá)量則較低。在不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)趨勢(shì)則一致

7、:6個(gè)基因在65 d胚胎的骨骼肌中表達(dá)量最高,90 d趨于降低,在33 d和成年豬的骨骼肌中表達(dá)量很低,這證實(shí)65 d左右的胚胎是肌纖維分化的最旺盛階段,基因的表達(dá)水平較高,隨后會(huì)逐漸降低。
　　 5.利用DHPLC檢測(cè)、EST拼接策略,對(duì)NDUFAB1、NDUFS3、NDUFS5和SMTN基因進(jìn)行了多態(tài)位點(diǎn)的篩查,在NDUFAB1中發(fā)現(xiàn)一個(gè)G/A突變,可引起限制性?xún)?nèi)切酶MspA1I的切割位點(diǎn)改變；用DHPLC技術(shù)在NDUFS3

8、中檢測(cè)到1個(gè)Exon突變A/G,可引起氨基酸改變,有2個(gè)BFaI的酶切位點(diǎn)；在NDUFS5中檢測(cè)到一個(gè)C/G突變；在SMTN中檢測(cè)到一個(gè)C/T突變,該突變位于Exon,可引起氨基酸改變。
　　 6.用DHPLC和酶切法對(duì)4個(gè)SNP在通城、大×長(zhǎng)×通、長(zhǎng)×大×通、大白、長(zhǎng)白、貴州香豬、五指山豬和巴馬香豬群體中的基因型頻率和基因頻率分布進(jìn)行了檢測(cè),NDUFAB1基因的GG基因型頻率0.526,GA基因型頻率0.428,AA基因型頻率

9、0.046；對(duì)于基因頻率,大白豬群的A等位基因頻率高,而通城豬和長(zhǎng)白豬的A等位基因頻率極低。NNDUFS3基因的AA基因型頻率0.699,AG基因型頻率0.275,GG基因型頻率0.026,A等位基因在各個(gè)群體中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)分布；NDUFS5基因的CC基因型頻率0.650,CG基因型頻率0.312,GG基因型頻率0.038,C等位基因顯示出優(yōu)勢(shì)分布?？梢缘贸鼋Y(jié)論:這3個(gè)基因的基因型呈嚴(yán)重的偏態(tài)分布。對(duì)于SMTN基因,TT基因型頻率0.547

10、,TC基因型頻率0.267,CC基因型頻率0.186,大×長(zhǎng)×通群體中無(wú)TT基因型個(gè)體,五指山群體中無(wú)CC基因型個(gè)體,且CT基因型個(gè)體只有1個(gè),貴州香豬群體中CC基因型個(gè)體只有3個(gè),而巴馬香豬群體中全部為T(mén)T基因型個(gè)體,因此對(duì)于基因頻率,在地方品種中T等位基因分布占優(yōu)勢(shì)。
　　 7.利用SPSS的GLM多因素方差分析法,對(duì)通城群體的15個(gè)生產(chǎn)性狀指標(biāo)進(jìn)行了基因型和性狀的關(guān)聯(lián)分析。對(duì)于NDUFAB1基因,基因型與腿臀比率(Ham)

11、極顯著相關(guān),其中GG基因型與GA基因型、GG基因型與AA基因型之間差異極顯著,而GA與AA基因型之間差異不顯著?；蛐团c肌內(nèi)脂肪含量(IMF)顯著相關(guān),其中GG基因型與GA基因型、GG基因型與AA基因型之間差異極顯著,而GA與AA基因型之間差異顯著。基因型與其它性狀無(wú)顯著相關(guān),但LSD比較發(fā)現(xiàn)平均日增重(ADG)、眼肌面積(LMA)、平均背膘厚(BF)、大理石紋評(píng)分(MS)、剪切力(Shear force)的基因型間兩兩比較有差異。對(duì)于

12、NDUFS3基因:基因型與平均背膘厚趨于顯著相關(guān),其中AA與GG基因型差異極顯著,AA與AG、AG與GG基因型差異顯著。基因型與其它性狀無(wú)顯著相關(guān),但LSD比較發(fā)現(xiàn)板油率(LFP)、平均背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量、屠宰率(DP)、腿臀比率和眼肌面積的基因型間兩兩比較有差異。對(duì)于NDUFS5基因:基因型與腿臀比率極顯著相關(guān),但基因型之間的差異不顯著；基因型與達(dá)90kg日齡(Age)趨于顯著相關(guān),各基因型之間差異不顯著。對(duì)于SMTN基因:基因型與

13、腿臀比率極顯著相關(guān)。基因型與平均日增重、肌內(nèi)脂肪含量、平均背膘厚、屠宰率、眼肌面積無(wú)顯著相關(guān),但各基因型之間有差異。T檢驗(yàn)法顯示,血液生理生化指標(biāo)甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)的基因型間差異極顯著,而載脂蛋白B(APO-B)、白細(xì)胞數(shù)(W