鼠成年新皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)和缺糖缺氧實驗方法研究及LPA調(diào)節(jié)腦糖異生的信號途徑的探討.pdf

1、一、目的：從成年動物分離的神經(jīng)元的成功培養(yǎng)相當困難,其中新皮層成年神經(jīng)元的體外培養(yǎng)更加困難,因此用于研究神經(jīng)生理的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞一般限于胚胎或年輕神經(jīng)元。然而,胚胎或年輕神經(jīng)元并不是研究年齡相關(guān)生理機制與遲發(fā)性疾病的最佳細胞。最近的一些文獻說明,成年神經(jīng)元也能在體外培養(yǎng)成活。這里我們報道一個從成年鼠腦新皮層獲得的神經(jīng)元體能在外培養(yǎng)成功的方法。在獲得單個神經(jīng)元的過程中,神經(jīng)元遭受機械、化學消化以及缺氧等損害,細胞出現(xiàn)代謝及功能障礙,

2、細胞會出現(xiàn)水腫、破碎,神經(jīng)元的粘附能力以及細胞活性也會下降。因此我們推測減輕水腫、促進細胞粘附會有效改善細胞體外培養(yǎng)。白蛋白具有減輕水腫與結(jié)合多種有機物質(zhì)的能力。因此我們推測減輕細胞水腫、提高細胞粘附能力有助于神經(jīng)元的體外生存。由于白蛋白具有以上兩種功能,我們進而推測白蛋白具有改善神經(jīng)元培養(yǎng)的能力。 方法：0.05％-1％牛血清白蛋白成分V用于神經(jīng)元培養(yǎng),研究不同濃度的白蛋白對神經(jīng)元活力、粘附細胞數(shù)的影響。 結(jié)果：0.1

3、-0.5％牛血清白蛋白能有效的促進細胞粘附、提高細胞活力。7天培養(yǎng)后,我們能獲得90％純度的成年皮層神經(jīng)元。 結(jié)論：適當濃度的牛血清白蛋白成分V能有效的促進細胞粘附、提高細胞活力。 二、目的：氧糖剝奪試驗(Oxygen and glucose deprivation,OGD)是體外研究缺血的公認模型,這一模型已廣泛應(yīng)用于研究心腦缺血機制。然而,經(jīng)過數(shù)十年的改進,盡管實驗方法越來越簡單、易于操作,而且。但由于標準不一,在進

4、行部分缺氧或者不同程度缺氧程度實驗中,同樣濃度的低氧環(huán)境,不同的實驗者描述的缺氧時間常會不一致。由于氧濃度不同,對細胞的影響不同。低氧會刺激細胞生長,而缺氧會造成細胞損害。這些混亂讓讀者無法對試驗結(jié)果進行精確的結(jié)果評價。因此,對缺氧程度、時間的精確描述有助于OGD試驗結(jié)果的描述。考慮到體外缺氧試驗進行時,細胞或組織利用的氧氣實際是溶解在培養(yǎng)基中的溶解氧,因此我們以溶解氧分壓高低作為缺氧程度的指標,并以到達缺氧標準時間點開始計算時間。

5、 方法：在同一濃度氧與培養(yǎng)基數(shù)量一致環(huán)境下,檢測不同數(shù)量培養(yǎng)細胞形成的溶解氧分壓從正常氧分壓下降到缺氧氧分壓標準的時間曲線；在同一濃度氧與培養(yǎng)的細胞數(shù)量一致環(huán)境下,檢測不同數(shù)量培養(yǎng)基形成溶解氧分壓從正常氧分壓下降到缺氧氧分壓標準的時間曲線； 結(jié)果：在到達缺氧標準之前,細胞數(shù)多的溶解氧分壓下降比細胞數(shù)少的快；培養(yǎng)基體積少的溶解氧分壓比體積多的下降快。但最后都會下降亦較為恒定的平臺期。 結(jié)論：缺氧的時間應(yīng)該從測到溶液中氧

6、分壓達到缺氧標準開始計時。而缺氧前的時間為低氧刺激時間而不是缺氧時間。只有先進行“定量細胞-定量培養(yǎng)基-溶解氧分壓-時間”預(yù)實驗,找出達到預(yù)定缺氧分壓得時間點,才能精確決定缺氧時間長短。 三、高血糖是預(yù)測缺血性或出血腦中風的住院病人發(fā)病和/或致死的一個獨立因素。導(dǎo)致高血糖癥的機制并不十分清楚,但研究顯示異常糖異生是原因之一。傳統(tǒng)的概念認為，腦不能進行糖異生。但近年來的研究表明：腦星型膠質(zhì)細胞能利用乳酸,表達控制糖異生的關(guān)鍵酶。因

7、此，推測腦中風時星型膠質(zhì)細胞進行糖異生是導(dǎo)致高血糖癥的原因之一?？紤]到腦中風疾病不但導(dǎo)致血糖升高,還導(dǎo)致血中溶血磷脂酸(LPA,Lysophosphatidic Acid)升高值,且LPA是導(dǎo)致高血糖癥病人胰島素抵抗的原因之一。為進一步推測LPA會調(diào)節(jié)腦星型膠質(zhì)細胞的糖異生,將培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細胞在糖剝脫的條件下處理,細胞分未加與不加LPA組。并對各組予以細胞信號阻斷劑分別處理。結(jié)果顯示：在剝奪糖的培養(yǎng)中：沒有LPA細胞也能表達G6Pas

8、e,這一表達不會被Bis、Xes-C或Xes-C+Bis阻斷,但會被PTX與Neomycin阻斷；加入LPA情況與不加LPA完全一樣。結(jié)果還顯示：有糖培養(yǎng)時，無LPA時G6Pase并不表達,PTX、Neomycin以及Bis均不能刺激G9Pase的表達,但加入Xes-C或Xes-C+Bis時細胞會表達G6Pase;LPA可以刺激G6Pase的表達,而且該表達可以被Bis、Xes-C以及Bis+Xes-C阻斷,但不被PTX或Neomyci