γ射線致人淋巴母細胞及其旁效應(yīng)細胞FHIT、PTEN表達變化及分子機制的研究.pdf

1、隨著核能在國民經(jīng)濟和軍事領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛,電離輻射對人類潛在的危害也不斷增加。一般認為輻射造成細胞核DNA分子嚴重損傷,使某些受照體細胞中特定的基因或染色體發(fā)生突變,其中涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活或突變、DNA錯配損傷修復反應(yīng)、細胞增殖失控及信號轉(zhuǎn)導通路的改變等因素的綜合作用。其機制的研究是電離輻射生物學效應(yīng)研究的熱點和難點之一。值得關(guān)注的是,自從國外學者提出電離輻射旁效應(yīng)概念以來,許多研究者證實旁效應(yīng)的存在,對“照射細

2、胞核才會引起細胞致命的損傷”“只有受照射細胞才受到損傷”等某些傳統(tǒng)觀念提出了有力的挑戰(zhàn),輻射誘導的基因不穩(wěn)定性、細胞質(zhì)受到照射所致的突變及旁效應(yīng)等在輻射致癌中同樣具有重要作用,并得到放射生物學界的確認。雖然電離輻射旁效應(yīng)的機制遠未了解,但旁效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)和研究對于低劑量放射生物效應(yīng)本質(zhì)的深入理解及揭示輻射致癌分子機制具有重要的理論意義和實際價值。 輻射誘導旁效應(yīng)是指未直接受照射細胞表現(xiàn)出與受照射細胞類似的生物學反應(yīng)。國內(nèi)外關(guān)于旁效應(yīng)

3、的研究主要集中在兩方面：第一是效應(yīng)研究,包括細胞凋亡或延遲死亡、基因不穩(wěn)定性、突變、基因表達改變、炎癥反應(yīng)、微核形成以及細胞生長異常等。第二是旁效應(yīng)機制研究?，F(xiàn)有的資料表明旁效應(yīng)機制是： (1)活性氧作用：用α粒子照射正常人成纖維細胞,發(fā)現(xiàn)細胞間O2-、H2O2的產(chǎn)生,并發(fā)現(xiàn)膜上還原酶Ⅱ氧化酶在細胞間ROS增高起重要作用。如用抗氧化劑DMSO處理細胞,發(fā)現(xiàn)SCE突變量明顯降低。由此可見,電離輻射旁效應(yīng)引起細胞損傷機制至少部分間接

4、地與ROS有關(guān)。 (2)細胞因子作用：實驗證實,低劑量α粒子照射人成纖維細胞的培養(yǎng)基,引起未照射細胞的增殖,并引起照射細胞的上清液中SOD和TGF-β1的濃度增加。另一實驗證實,IL-8作為一種信號分子在輻射旁效應(yīng)中起重要作用。除此之外,線粒體在氧化應(yīng)激時分泌的凋亡誘導因子(AIF)也可能與電離輻射旁效應(yīng)有關(guān)系。 (3)細胞間縫隙連接通訊：研究者認為,照射細胞數(shù)量(細胞密度)是輻射旁效應(yīng)的主要相關(guān)參數(shù)。可能由于細胞密度大

5、,細胞縫隙連接通訊發(fā)生作用,使許多物質(zhì)釋放到培養(yǎng)基而發(fā)生旁效應(yīng)。另外,電離輻射旁效應(yīng)的細胞間信號傳遞涉及到能量代謝,其中ATP產(chǎn)生或NAD/NADP減少,可能是輻射旁效應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵。值得注意的是：對于哪類基因在輻射產(chǎn)生的旁效應(yīng)中起作用直到目前,輻射旁效應(yīng)及其機制遠未了解。脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因是1996年Ohta等用差異顯示分析探針和外顯子捕獲法在染色體3p14.2區(qū)域新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,全長約1Mb。其cDNA長1095bp,

6、由10個外顯子組成,其5'端含有一段長約350bp的非編碼區(qū),包含外顯子1～3;外顯子5～9組成一長約500bp的開放性閱讀框架,編碼一個由147個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為16.8×103D的蛋白質(zhì)。FHIT在生物機體內(nèi)起廣泛的作用,包括:①調(diào)控細胞周期,②誘導細胞凋亡,③FHIT蛋白水解酶活性,④促進微管組裝。 10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因,定位在染色

7、體10q23.3上,有9個外顯子,編碼由403個氨基酸組成的蛋白。PTEN與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學特性密切相關(guān),在生物機體內(nèi)起廣泛的作用,包括:①調(diào)控細胞周期,②誘導細胞凋亡,③調(diào)節(jié)細胞粘連、遷移和分化。 本研究從細胞、基因和蛋白水平對電離輻射細胞及其旁效應(yīng)細胞FHIT、PTEN表達變化及分子機制進行了初步研究。 研究內(nèi)容: 1.60Coγ射線照射人淋巴細胞(AHH-1)及與其細胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照

8、射細胞增殖能力的變化、細胞周期的改變和早期凋亡的情況。 2.60Coγ射線致AHH-1細胞及與其細胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照射細胞不同時間點FHIT、PTENmRNA及蛋白表達變化的研究。 3.氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預處理后,不同劑量60Coγ射線致AHH-1細胞及與其細胞和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)未照射細胞在不同時間點FHIT、PTEN蛋白表達變化,以及對細胞增殖、細胞早期凋亡和周期的影響。 實驗方法:

9、 1.旁效應(yīng)細胞模型的制備：正常人淋巴細胞(AHH-1)經(jīng)0.5、2和5Gy60Coγ射線照射后立即離心,將直接受照細胞與未受照細胞按1:1比例在Transwell中共同培養(yǎng),另將離心后未過濾的受照細胞培養(yǎng)液與未受照細胞在25cm2培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng),未經(jīng)照射組設(shè)為對照,細胞處理好后,在37℃、5％CO2條件下細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.應(yīng)用細胞計數(shù)法觀察未受照細胞、受照細胞和旁效應(yīng)細胞增殖變化,流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡和周期變

10、化。 3.應(yīng)用RT-PCR、Western Blot方法檢測未受照細胞、受照細胞和旁效應(yīng)細胞在照后即刻、6、12、24h抑癌基因FHIT、PTENmRNA及蛋白水平表達情況。 4.AHH-1細胞經(jīng)氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預處理后,按1步驟制備旁效應(yīng)細胞模型,重復2、3實驗,觀察細胞經(jīng)DMSO預處理前后FHIT、PTEN蛋白水平表達情況,以及細胞增殖、凋亡和周期變化情況。 5.統(tǒng)計學方法：單樣本t檢驗、

11、單因素方差分析。 結(jié)果: 1.直接受照細胞在照射后出現(xiàn)細胞增殖能力下降,早期凋亡增加,細胞增殖出現(xiàn)G2期阻滯,各組旁效應(yīng)細胞也出現(xiàn)相同的現(xiàn)象,且旁效應(yīng)細胞早期凋亡與照射劑量無明顯相關(guān)性。 2.與對照組比較,直接受照及旁效應(yīng)細胞FHIT mRNA表達呈下降,但變化不顯著；直接受照及旁效應(yīng)細胞FHIT蛋白表達均呈下降趨勢,吸收劑量為0.5Gy時,其變化不顯著；隨劑量的增加,FHIT蛋白表達下降越顯著,尤其是照射劑量達

12、2.0Gy以上時,FHIT蛋白表達顯著下降,存在比較明顯的劑量依賴性。直接受照細胞在照射后24小時下調(diào)幅度最大,旁效應(yīng)細胞在照射后12小時下調(diào)幅度最大。 3.直接受照及旁效應(yīng)細胞PTEN mRNA表達呈下降趨勢,但變化不顯著。PTEN蛋白表達下調(diào)程度與細胞的處理方式有關(guān),以受照細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的旁效應(yīng)細胞表達下調(diào)最為顯著,且高于直接受照細胞。但在處理后12h檢測其蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)受照細胞共同培養(yǎng)組中0.5Gy旁效應(yīng)細胞較2Gy旁

13、效應(yīng)細胞下調(diào)明顯,與照射劑量無關(guān)。該結(jié)果目前未見報道。 4.經(jīng)氧自由基清除劑二甲基亞砜(DMSO)預處理后,受照細胞、受照細胞共培養(yǎng)細胞、受照細胞培養(yǎng)液處理細胞較未處理細胞比較,各組細胞PTEN、FHIT蛋白表達均有所上調(diào),且早期凋亡及G2期阻滯情況也有所改變。 結(jié)論: 1.受照細胞共培養(yǎng)細胞和受照細胞培養(yǎng)液處理細胞均出現(xiàn)與直接受照細胞相同的增殖能力下降現(xiàn)象,且下降幅度與照射劑量相關(guān)及處理條件有關(guān)。 2.

14、受照細胞、受照細胞共培養(yǎng)細胞和受照細胞培養(yǎng)液處理細胞在處理后24h,細胞早期凋亡均出現(xiàn)增加,直接受照細胞早期凋亡率與照射劑量存在明顯的相關(guān)性,而旁效應(yīng)細胞凋亡率與照射劑量相關(guān)不顯著。 3.旁效應(yīng)細胞組與直接受照細胞組均出現(xiàn)G2期阻滯現(xiàn)象。 4.直接受照及旁效應(yīng)細胞FHIT mRNA表達呈下降趨勢,但改變不顯著,較高劑量(2.0-5.0Gy)60Coγ射線能導致直接受照細胞FHIT蛋白表達顯著下調(diào),且存在劑量依賴關(guān)系,照射

15、劑量越大,其下調(diào)越顯著。旁效應(yīng)細胞FHIT蛋白表達表現(xiàn)出與直接照射細胞一致的變化趨勢,蛋白下調(diào)水平幅度在細胞處理后12h最為明顯,且受照細胞共培養(yǎng)組下降幅度高于直接照射細胞。該結(jié)果目前未見報道。 5.直接受照及旁效應(yīng)細胞PTEN mRNA表達呈下降趨勢,但改變不顯著,不同劑量受照細胞PTEN蛋白表達呈下調(diào)趨勢,且存在劑量依賴關(guān)系,照射劑量越大,其下調(diào)越顯著。不同劑量旁效應(yīng)細胞PTEN蛋白表達也表現(xiàn)出下調(diào)趨勢,在細胞處理后12h最

16、為明顯,下調(diào)程度與細胞的處理方式有關(guān),以受照細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的旁效應(yīng)細胞表達下調(diào)最為顯著,但受照細胞共同培養(yǎng)組中0.5Gy旁效應(yīng)細胞較2Gy旁效應(yīng)細胞下調(diào)明顯,分析抑癌基因PTEN在低劑量(0.5Gy)照射時較敏感。該結(jié)果目前未見報道。 6.AHH-1細胞經(jīng)氧自由基清除劑DMSO處理后,再經(jīng)上述條件處理,并與上述結(jié)果比較,分析氧自由基清除劑對受照細胞有一定的保護作用,可以使抑癌基因FTEN、PTEN受損減少,使其維持正常生理功能,