載脂蛋白E對創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響及意義.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）后以細胞凋亡為主要特征的繼發(fā)性腦損害是影響病情轉(zhuǎn)歸的重要因素，但目前具體機制尚不十分清楚。載脂蛋白E（ApoE代表蛋白，APOE代表基因）是腦內(nèi)的主要載脂蛋白，除了脂質(zhì)代謝方面的作用外，具有重要的神經(jīng)生物學功能。課題組及國外研究發(fā)現(xiàn)，APOE基因敲除鼠與野生鼠相比，顱腦損傷后腦組織易損性顯著增加，提示APOE在顱腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但完整的apoE分子量大，正常狀態(tài)下不能通過血腦屏障。COG1410是一種來

2、源于ApoE受體結(jié)合區(qū)的人工合成小分子多肽，克服了apoE全蛋白不能通過血腦屏障的缺點，給予COG1410可減少腦損傷后小鼠神經(jīng)細胞凋亡，改善神經(jīng)功能評分，從另一方面證實了ApoE與顱腦損傷的關系。但APOE影響顱腦損傷病情轉(zhuǎn)歸的機制尚不十分清楚，有待進一步研究。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）介導的細胞凋亡是繼傳統(tǒng)受體途徑和線粒體途徑后倍受關注的細胞凋亡途徑。適度的ERS可通過非折疊蛋白反應，增加分子伴侶表達，以抵抗應激，維持細胞

3、存活;持續(xù)或強烈的應激將通過激活其特有的促凋亡途徑介導細胞凋亡。而在顱腦損傷動物模型和體外實驗研究表明，TBI后ERS水平上升。而在TBI患者，ERS介導的細胞凋亡是否與顱腦損傷有關尚未見報道。
　　 同時，Osada等在腦缺血的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與WT鼠相比，APOE-/-鼠海馬CA1-CA2區(qū)神經(jīng)細胞凋亡明顯增多，且ERS水平上升趨勢更明顯。但是，APOE是否影響TBI后ERS水平？給予外源性擬ApoE短肽是否能抑制ERS發(fā)揮

4、其神經(jīng)保護作用？國內(nèi)外尚未見報道。
　　 因此，本研究通過觀察TBI患者及探討ERS在TBI中的作用及ApoE對TBI后ERS的影響及意義。在TBI患者采用免疫組化法檢測CHOP顱腦創(chuàng)傷周圍組織表達，并分析其與GCS評分及細胞凋亡關系;并進一步檢測在APOE敲除鼠及野生鼠（含APOE）小鼠顱腦損傷模型中不同時間點ERS變化，同時觀察COG1410是否能改變TBI后ERS水平，應用TUNEL檢測細胞凋亡，以探討ApoE對TBI后內(nèi)

5、質(zhì)網(wǎng)應激的影響及意義，從而為深入闡明ApoE在TBI后的神經(jīng)保護作用提供實驗資料。
　　 一、CHOP在嚴重創(chuàng)傷性顱腦損傷患者中的表達及意義
　　 目的：研究CHOP在嚴重創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)患者中的表達，并探討其與病情嚴重程度的關系。方法收集41例TBI患者顱腦創(chuàng)傷周圍組織，并選取因其他疾?。ㄅ懦齌BI及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。┧劳龅氖瑱z標本16例作為對照組。TBI組顱腦損傷傷情程度根據(jù)入院時GCS評分分為重型TBI

6、（GCS6-8分）組及特重型TBI組(GCS3-5)。采用免疫組化技術檢測CHOP在顱腦創(chuàng)傷周圍組織的表達，TUNEL檢測神經(jīng)細胞凋亡，并對CHOP表達水平與凋亡數(shù)量進行相關性分析。結(jié)果:與對照組相比，TBI組CHOP的表達顯著上調(diào)。在TBI組中，特重型TBI組明顯高于重型TBI組。TUNEL檢測結(jié)果表明，TBI組較對照組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯增加，且CHOP表達水平與凋亡指數(shù)呈正相關。結(jié)論:TBI后CHOP表達水平病情嚴重程度、神經(jīng)細胞

7、凋亡密切相關，提示ERS介導的細胞凋亡途徑可能在TBI的病理生理過程中起重要作用。
　　 二、顱腦損傷動物模型的建立:控制性皮質(zhì)沖擊損傷模型
　　 目的:建立一個可靠而穩(wěn)定、重復性好的顱腦損傷模型。方法:建立小鼠控制性皮質(zhì)沖擊損傷模型。對損傷后小鼠進行神經(jīng)功能評分，并從大體及顯微鏡下觀察各組不同時間點形態(tài)學差異，判定顱腦損傷模型是否成功建立。結(jié)果:致傷組同假手術組及對照組相比，神經(jīng)功能評分增加;形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)致傷組同假手

8、術組及對照組相比，局部神經(jīng)細胞凋亡、壞死明顯增加，腦組織水腫、炎細胞浸潤明顯。結(jié)論:成功建立小鼠皮質(zhì)沖擊顱腦損傷模型，并通過神經(jīng)功能評分及形態(tài)學觀察進一步鑒定，表明所建立的小鼠顱腦損傷模型符合實驗要求，為下一步研究提供模型保障。
　　 三、ApoE對TBI后ERS的影響及意義
　　 目的:在顱腦損傷動物模型中進一步研究TBI后ERS水平的改變及APOE對TBI后ERS的影響及意義。方法:將APOE基因敲除鼠及野生鼠各72

9、只隨機分為假手術組、致傷組、COG1410干預致傷組(n=24)，即APOE-/-假手術組、APOE-/-致傷組、APOE-/-致傷+COG1410組;WT假手術組、WT致傷組、WT致傷+COG1410組。各組按傷后灌注取腦時間又分為1d、3d、7d三個亞組(n=8)。Western blot、Real-timePCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記性分子GRP78及CHOP蛋白的表達，TUNEL檢測神經(jīng)細胞凋亡情況。再取APOE-/-鼠及WT鼠各2

10、7只隨機分為假手術組、TBI組、COG1410干預致傷組，并進行神經(jīng)功能評分(mNSS)。結(jié)果:1.與假手術組相比，WT致傷組GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達均明顯上調(diào)，GRP78表達于傷后1d達到高峰，而CHOP表達于傷后3d達到高峰。WT致傷組傷后神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯增加，且CHOP表達量與細胞凋亡指數(shù)呈正相關。mNSS評分在各時間點WT致傷組均高于假手術組。2.與WT致傷組相比，APOE-/-致傷組傷后GRP78、CHOP

11、的蛋白及mRNA表達的上調(diào)趨勢更明顯，且細胞凋亡數(shù)量顯著增多，mNSS評分增高。3.給予COG14010后，APOE-/-鼠及WT鼠較各自基因型小鼠致傷組GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達下降，且細胞凋亡減少，mNSS評分改善。結(jié)論:ERS在TBI后被激活，與TBI后繼發(fā)性顱腦損傷密切相關。敲除APOE基因后，ERS水平增加，細胞凋亡也增加，同時神經(jīng)功能損害也更重;而給予外源性擬ApoE短肽COG1410后可抑制TBI后ERS水平