角膜潰瘍修復材料生物羊膜的生物安全評價研究.pdf

1、目的：通過熱原、急性毒性、溶血、皮內(nèi)刺激、體外細胞毒性、潛在皮膚致敏性、沙門氏菌回復突變、染色體畸變(體內(nèi)哺乳動物骨髓細胞微核實驗)、精子致畸和亞慢性毒性試驗對生物羊膜的生物安全性進行較全面的評價。 方法： (1)在熱原試驗中，將一定劑量供試品靜脈注入家兔，觀察3只試驗用兔的體溫變化情況； (2)在急性全身毒性試驗中，將供試品分別通過靜脈和腹腔給予昆明鼠，在注射后4、24、48、72h觀察試驗組和對照組昆明鼠的一

2、般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)，以及72h后的動物體重； (3)在溶血試驗中，將新鮮制備的抗凝兔血加入供試品中，觀察各組是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，并測其吸光度； (4)在皮內(nèi)刺激試驗中，將供試品注射于家兔背部，觀察接種點的紅斑和水腫情況，并計算皮內(nèi)刺激反應指數(shù)； (5)在體外細胞毒性試驗中，將供試品與特定細胞系接觸，評價其對細胞的毒性作用和程度，并用MTT法測定細胞相對增殖率； (6)在潛在皮膚致敏試驗中，受試動物

3、經(jīng)供試品的兩步誘導和激發(fā)后，觀察激發(fā)部位皮膚情況； (7)在AMES試驗中，通過點滴板評價技術選擇對測交品系無抑制作用的提取液，用標準平板摻入方法進行測試，觀察各組的菌落生長情況，并計算被測樣品菌落計數(shù)平均值與陰性對照菌落計數(shù)平均值的比值； (8)在微核試驗中，將受試品腹腔給予受試動物，取其雙側(cè)股骨內(nèi)骨髓，制備涂片，油鏡觀察，計算各組PCEs占紅細胞總數(shù)的比值，用作骨髓毒性的指示，并進行統(tǒng)計學比較； (9)在精子

4、畸形試驗中，將受試物腹腔給予受試動物，分離附睪，制作涂片，觀察結構完整的1000個精子，計數(shù)其中畸形的精子，計算畸形精子發(fā)生率，采用秩和檢驗分析試驗組的精子畸變率與陰性對照組之間的差異； (10)在亞慢性毒性試驗中，將測試樣品無菌植入受試動物腹股溝面的皮下囊袋中，在整個植入期內(nèi)，每周稱重一次，并逐個進行詳細的臨床檢查。植入期結束后，進行實驗室觀察和病理解剖，并對觀察結果進行分析。 結果： (1)熱原實驗中，3只家

5、兔的體溫升高均低于0.6℃，且3只家兔的升溫總和低于1.4℃，可以認為生物羊膜沒有致熱性。 (2)在急性毒性試驗中，注射后立即觀察昆明鼠，沒有出現(xiàn)不良反應，在注射后4、24、48、72h繼續(xù)觀察試驗組和對照組昆明鼠的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)，以及72h后的動物體重，結果表明試驗組動物癥狀和體重的變化都在可接受的范圍之內(nèi)，可以認為生物羊膜無急性全身毒性作用。 (3)溶血試驗中陽性對照管中觀察到溶血現(xiàn)象，試驗品和陰性對

6、照管中未見溶血現(xiàn)象。移入比色皿內(nèi)測吸光度，得到試驗組溶血率為0.7％，＜5％，結果表明，生物羊膜沒有引起溶血反應。 (4)皮內(nèi)刺激試驗中，皮內(nèi)刺激反應指數(shù)為0.0，表明該試驗品無刺激作用。 (5)體外細胞毒性試驗中，顯微鏡下觀察可見陽性對照呈現(xiàn)明顯的細胞毒性，空白及陰性對照細胞形態(tài)正常，試驗組觀察到有極輕的毒性。定量測試結果表明，試驗品毒性為1級，空白對照為0級，而陽性對照為4級。定量測試和定性測試的結果均表明，生物羊膜

7、具有極輕的細胞毒性。 (6)潛在皮膚致敏試驗中，SC組和CSO組的致敏反應情況相同，二者的試驗組和陰性對照組的紅斑和水腫記分等級均為0，而陽性對照組的紅斑和水腫記分等級均≥1。所以在本項試驗條件下，生物羊膜無潛在皮膚致敏性。 (7)AMES試驗中，各個菌株的陰陽性的自發(fā)回變菌落數(shù)均按預期生長，陰性對照在各自的范圍內(nèi)，陽性對照回變菌落數(shù)均至少為陰性的2倍以上，試驗樣品回變菌落數(shù)與陰性對照基本無差異。計算被測樣品菌落計數(shù)平均

8、值與陰性對照菌落計數(shù)平均值的比值均介于0.5和2之間，表示菌株生長未受抑制，且受試品對各受試菌株無誘導作用。因此，本研究中試驗品提取液對各試驗菌株沒有誘導性，不具有致突變作用。 (8)微核試驗中，各組PCEs占紅細胞總數(shù)的比值的差別均無統(tǒng)計學意義，計算各組MPCEs在PCEs中所占的數(shù)量，陽性對照的雌雄兩組與樣品組(SC)的雌雄兩組的差別均有統(tǒng)計學意義，與樣品組(CSO)的雌雄兩組的差別也均有統(tǒng)計學意義，陰性對照(SC和CSO)

9、與樣品組(SC和CSO)的差別均無統(tǒng)計學意義。本次試驗結果表明，試驗組沒有出現(xiàn)細胞毒性的跡象，可以認為被測樣品浸提液不會對小鼠產(chǎn)生遺傳毒性。 (9)精子畸形試驗中，試驗組小鼠精子畸形發(fā)生率與陰性對照組比較差異無顯著性，而CP陽性對照組與陰性對照組比較有顯著差異。結果表明在本次研究的條件下，被測樣品浸提液并未表現(xiàn)出對小鼠產(chǎn)生遺傳毒性的跡象。 (10)亞慢性毒性試驗中，在整個試驗期間，試驗組和對照組對比，大鼠的一般行為、體重

10、增長、進食、尿常規(guī)、血液學、血生化、臟器重量及病理檢查均未見顯著性差異。在本次研究條件下，認為生物羊膜植入皮下組織92天后，沒有導致毒性效應的特異性變化，不會引起亞慢性毒性。 結論：生物羊膜在本研究的試驗條件下，無致熱性，不會引起急性全身毒性反應和溶血反應，無皮內(nèi)刺激反應，具有輕微的細胞毒性，對皮膚無潛在致敏性，無致突變作用，無遺傳毒性，無亞慢性毒性，因此，可以認為生物羊膜具有較高的生物安全性。關于生物羊膜在醫(yī)療器械領域的開發(fā)應